重金屬銻通過上調(diào)CtBP2表達(dá)促進(jìn)前列腺癌進(jìn)展機(jī)制.pdf

1、目的：
　　明確低劑量重金屬銻暴露后，對(duì)前列腺癌進(jìn)展產(chǎn)生的影響，并初步探討其作用機(jī)制。
　　方法：
　　采用MTT方法篩選銻暴露PC3細(xì)胞的亞致死劑量，并明確在該劑量下銻對(duì)PC3細(xì)胞增殖效應(yīng)的影響；明確銻暴露影響細(xì)胞增殖最顯著劑量后，用該劑量銻處理PC3細(xì)胞，分別通過細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)以及磷脂酰絲氨酸外翻法分析，研究銻暴露對(duì)細(xì)胞遷移能力、侵襲能力及凋亡能力的作用；采用基因轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的方法，研究低劑量銻

2、暴露 PC3細(xì)胞后，基因異常表達(dá)情況；根據(jù)基因測(cè)序結(jié)果，分別采用RT-qPCR及Western Blot方法，研究低劑量銻暴露對(duì)CtBP2以及下游蛋白轉(zhuǎn)錄翻譯水平的影響；通過比對(duì)CtBP2轉(zhuǎn)錄起始上游DNA序列，查詢金屬效應(yīng)元件（MRE）結(jié)構(gòu)，構(gòu)建MRE表達(dá)質(zhì)粒后轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，予以低劑量銻暴露后，進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，證明MRE結(jié)構(gòu)與低劑量銻暴露的關(guān)系；建立銻暴露裸鼠荷瘤實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ秃?，明確低劑量銻對(duì)裸鼠及皮下腫瘤生長(zhǎng)的影響

3、，并記錄裸鼠體重及皮下種植瘤體積變化，繪制生長(zhǎng)曲線，采用Western Blot方法檢測(cè)其腫瘤組織中CtBP2以及下游蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　低劑量銻暴露可促進(jìn)PC3細(xì)胞增殖，并發(fā)現(xiàn)在銻暴露劑量為8uM時(shí)，其促進(jìn)增殖效應(yīng)最為顯著(P<0.05)；以8uM銻暴露PC3細(xì)胞后，細(xì)胞遷移以及侵襲能力均顯著增加(P<0.05)，但并不能增加其抗凋亡能力；根據(jù)基因轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，低劑量銻暴露PC3細(xì)胞后，多種基因出現(xiàn)顯著的差異

4、性表達(dá)，其中包括CtBP2表達(dá)水平顯著增加(P<0.05)；根據(jù)RT-qPCR方法驗(yàn)證，低劑量銻暴露后PC3細(xì)胞中CtBP2 mRNA顯著增加，結(jié)合Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，CtBP2以及下游c-Myc、HSPC111蛋白表達(dá)水平顯著增高(P<0.05)；通過比對(duì)CtBP2 DNA序列，證明其轉(zhuǎn)錄起始上游具有金屬效應(yīng)元件（MRE）結(jié)構(gòu)，因此 CtBP2為 MRE調(diào)控的效應(yīng)基因；成功構(gòu)建金屬效應(yīng)元件表達(dá)質(zhì)粒后，雙熒光素酶報(bào)告基

5、因系統(tǒng)結(jié)果證明，低劑量銻可以與該結(jié)構(gòu)發(fā)生相互作用，進(jìn)一步促進(jìn)下游 CtBP2表達(dá)增加；建立低劑量銻暴露裸鼠荷瘤實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ秃?，?duì)照組與10mg/kg/d組裸鼠皮下種植瘤體積分別為(1344.9±882.8)mm3以及(2612.4±777.5)mm3，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，結(jié)果證實(shí)低劑量銻可顯著促進(jìn)裸鼠種植瘤生長(zhǎng)；而通過 Western Blot實(shí)驗(yàn)證明在低劑量銻暴露后的裸鼠腫瘤組織中，CtBP2以及下游c-Myc、HSPC111