鞘脂激活蛋白C促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞增殖、上調(diào)AR功能的分子機(jī)制研究.pdf

1、鞘脂激活蛋白原(Prosaposin)是一種高度保守的熱穩(wěn)定糖蛋白(65-72kDa，527氨基酸殘基)，其基因位于10號染色體長臂(q21-22)，全長17kb，有14個外顯子。鞘脂激活蛋白原經(jīng)水解后產(chǎn)生4種熱穩(wěn)定糖蛋白--鞘脂激活蛋白A、B、C、D(SaposinA、B、C、D)，它們在溶酶體酶解鞘脂的過程中發(fā)揮重要作用。另外，作為一種分泌蛋白，鞘脂激活蛋白原還具有神經(jīng)營養(yǎng)作用，能夠促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)源性細(xì)胞突觸增長、細(xì)胞增殖以及增加其抗

2、凋亡的能力，其神經(jīng)營養(yǎng)活性位于Saposin C的N端氨基酸序列(LIDNNRTEELLY)。Prosaposin、Saposin C以及包含這一功能區(qū)域的合成肽，如Prosaptide TX14A都可以與神經(jīng)細(xì)胞膜上百日咳毒素敏感的細(xì)胞膜G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)結(jié)合，刺激神經(jīng)細(xì)胞中乙酰膽堿酯酶的活性，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的生長和分化。 鞘脂激活蛋白原分布于神經(jīng)細(xì)胞和體液，除了其神經(jīng)營養(yǎng)活性之外，在外周組織的廣泛分布，提示可能還有其它

3、生物活性。2004年Koochekpour S等報道鞘脂激活蛋白原在前列腺癌組織中高表達(dá)；并通過化學(xué)合成的Saposin C以及Prosaptide TX14A進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其可以通過MAPK途徑、PI3K/Akt途徑等信號通路促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的生長、增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲，并且抑制癌細(xì)胞的凋亡。 前列腺癌是死亡率很高的惡性腫瘤，潛伏期長，易復(fù)發(fā)，且復(fù)發(fā)后往往轉(zhuǎn)變?yōu)樾奂に胤且蕾囆郧傲邢侔?Androgen-independent pr

4、ostate cancer，AIPC)，臨床上缺乏有效的治療手段。目前發(fā)現(xiàn)有多種機(jī)制參與AIPC的演變過程，其中雄激素受體(androgen receptor,AR)相關(guān)途徑的異?；罨茿IPC發(fā)生發(fā)展的主要分子機(jī)制。AR作為核轉(zhuǎn)錄因子，通過介導(dǎo)雄激素的作用，結(jié)合于靶基因的特異元件AREs(androgen receptor elements)后，調(diào)節(jié)靶基因如前列腺特異抗原(Prostate-specific antigen，PSA)、

5、人腺激肽釋放酶2(human glandular kallikrein，hk2)等的表達(dá)，從而對前列腺的正常發(fā)育、調(diào)控其分泌功能發(fā)揮重要作用。而AR基因的擴(kuò)增、突變，AR的輔助激活因子過表達(dá)，一些細(xì)胞因子、生長因子對AR的激素非依賴性激活，以及雄激素通過非基因組的(nongenomic)信號途徑對AR功能的調(diào)節(jié)等，使AR在激素非依賴性前列腺癌中持續(xù)活化而發(fā)揮功能。由于Saposin C以及Prosaptide TX14A能夠促進(jìn)前列腺癌

6、細(xì)胞增殖，而AR在前列腺癌細(xì)胞的增殖中起重要作用，本研究旨在探討Saposin C及其功能結(jié)構(gòu)域一一鞘脂激活肽NP(Neurotrophic Peptide，NP)對AR表達(dá)和功能影響。我們首先構(gòu)建含有Saposin C或NP與Tat-PTD蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域序列的融合蛋白的真核表達(dá)載體及其對照載體。Tat-PTD蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域具有不依賴ATP和膜通道、高效穿過生物膜的功能，它能將與其共價連接的多肽、蛋白質(zhì)及DNA等分子跨膜運(yùn)輸出入幾乎所有的組

7、織和細(xì)胞。由于Saposin C為分泌蛋白，并通過膜受體介導(dǎo)其功能，我們在Saposin C/NP前面引入Tat-PTD，使Saposin C能通過Tat-PTD的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)功能實現(xiàn)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)并發(fā)揮作用。利用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染雄激素依賴性前列腺癌細(xì)胞(LNCaP)和雄激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞(PC3、DU145)，通過MTT、RT-PCR、Western Blot、熒光素酶活性分析、免疫熒光技術(shù)及免疫共沉淀等方法分析Saposin C/NP對前列

8、腺癌細(xì)胞生長的影響以及對AR.基因表達(dá)和功能的影響。我們的研究結(jié)果如下： (1)載體構(gòu)建：以pcDNA3.1(+)為母載體，構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA-TAT-NP和pcDNA-NP；以帶有myc和His標(biāo)簽的pcDNA3.1/myc-HisB(-)為母載體，插入SaposinC或NP序列分別得到pcDNA-TAT-Saposin C、pcDNA-Saposin C、pcDNA-NP/His的表達(dá)載體，測序分析序列正確。RT-P

9、CR以及利用His標(biāo)簽進(jìn)行Western Blot實驗，分別在mRNA和蛋白水平檢測所構(gòu)建載體的表達(dá)，結(jié)果表明TAT-SaposinC、SaposinC、TAT-NP、NP均能夠在前列腺癌細(xì)胞中表達(dá)； (2)確定SaposinC和NP蛋白在細(xì)胞中的定位：免疫熒光技術(shù)檢測結(jié)果表明，TAT-Saposin C定位于細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞膜外，而Saposin C和NP只分布于細(xì)胞內(nèi)； (3)確定Saposin C/NP對細(xì)胞增殖的影響

10、：流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明，NP及TAT-NP能夠促使細(xì)胞進(jìn)入S和G2/M期；MTT結(jié)果表明， TAT-Saposin C、Saposin C、TAT-NP和NP均能刺激激素依賴型及激素非依賴型前列腺癌細(xì)胞的增殖； (4)確定Saposin C/NP對AR表達(dá)和功能的影響：RT-PCR、Western Blot結(jié)果顯示，在mRNA和蛋白水平，TAT-Saposin C、Saposin C、TAT-NP和NP均能增加AR基因的表達(dá)，并增

11、強(qiáng)AR promoter的表達(dá)活性；通過檢測PSApromoter、hk2-3ARE報告基因的表達(dá)活性，證實TAT-Saposin C、Saposin C、TAT-NP和NP均能夠增強(qiáng)AR的轉(zhuǎn)錄激活活性，促進(jìn)AR的靶基因PSA、hk2的表達(dá)： (5)確定SaposinC/NP對AR核定位的影響：免疫熒光結(jié)果顯示，TAT-SaposinC、Saposin C和NP在雄激素缺乏的情況下，能夠使AR激活并定位于細(xì)胞核； (6)

12、確定SaposinC/NP激活A(yù)R可能的機(jī)制：AR蛋白的磷酸化是AR活化、定位于細(xì)胞核的重要方式，MAPK和PI3K/Akt信號途徑均是使AR磷酸化的重要途徑。由于無TAT蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的SaposinC和NP定位于細(xì)胞內(nèi)，但仍然能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖，促進(jìn)AR的表達(dá)、功能以及促進(jìn)AR的核定位。首先通過采用百日咳毒素封閉細(xì)胞膜上的G蛋白受體，發(fā)現(xiàn)Saposin C、NP仍能增強(qiáng)AR的轉(zhuǎn)錄激活功能，促進(jìn)PSA promoter和hk2-3ARE

13、的表達(dá)活性，說明膜受體可能不參與Saposin C、NP激活A(yù)R的過程；采用蛋白酶抑制劑封閉PI3K/Akt途徑后，并不影響胞內(nèi)Saposin C對ERK的磷酸化，繼而不影響AR的磷酸化活化；采用免疫熒光和免疫共沉淀技術(shù)進(jìn)一步證實Saposin C、NP分別與Src蛋白產(chǎn)生蛋白一蛋白間相互作用，同時促進(jìn)Src與AR蛋白一蛋白間的相互作用。上述結(jié)果提示Saposin C/NP活化AR的過程可能不依賴于細(xì)胞膜G蛋白受體，可能通過與Src蛋白

14、相互作用，促進(jìn)Src與AR的結(jié)合進(jìn)而激活Src活化AR的信號途徑，最終使AR磷酸化激活。 總之，真核表達(dá)載體Saposin C/NP在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)能夠促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞增殖，增強(qiáng)AR的表達(dá)和功能,促進(jìn)AR核定位，其機(jī)制可能不依賴于細(xì)胞膜上的G蛋白受體途徑，而是通過與非受體酪氨酸蛋白激酶Src產(chǎn)生蛋白一蛋白相互作用，活化Src激活A(yù)R的信號途徑，使AR磷酸化激活，促進(jìn)下游靶基因的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖。另外，我們的實驗結(jié)果也表明，S