MEPE蛋白影響前列腺癌細(xì)胞遷移作用機(jī)制研究.pdf

1、目的：研究細(xì)胞外基質(zhì)磷酸糖蛋白（MEPE）在前列腺癌細(xì)胞中的表達(dá)水平對(duì)前列腺癌細(xì)胞遷移能力的影響，以及MEPE蛋白影響細(xì)胞遷移能力的機(jī)制與小G蛋白家族蛋白PI3K/Rac1/PAK1通路的關(guān)系。為闡明腫瘤浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：構(gòu)建腺病毒包裝質(zhì)粒pYr-ads-4-mMEPE與pYr-ads-4-siMEPE，在HEK293細(xì)胞中包裝形成腺病毒顆粒，分別轉(zhuǎn)染正常前列腺上皮細(xì)胞株RWPE1與前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C3，同時(shí)

2、轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒作為對(duì)照細(xì)胞株。免疫印跡檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞株中MEPE蛋白表達(dá)水平，確定轉(zhuǎn)染效果。通過經(jīng)典的劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell侵襲/遷移實(shí)驗(yàn)對(duì)比人為上調(diào)或下調(diào)MEPE蛋白表達(dá)水平的細(xì)胞株以及其對(duì)應(yīng)的空載體的細(xì)胞株之間侵襲/遷移能力的差異。進(jìn)一步采用免疫印跡方法檢測(cè)MEPE蛋白表達(dá)水平不同的各個(gè)細(xì)胞株內(nèi)信號(hào)通路PI3K/Rac1/PAK1的信號(hào)蛋白表達(dá)水平是否也隨之改變。
　　結(jié)果：⑴經(jīng)酶切與測(cè)序驗(yàn)證，pYr-ads-4-mMEPE與

3、pYr-ads-4-siMEPE重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，免疫印跡分析驗(yàn)證轉(zhuǎn)染rAd-4-mMEPE的RWPE1細(xì)胞株中MEPE蛋白表達(dá)水平上調(diào)，轉(zhuǎn)染rAd-4-siMEPE的PC3細(xì)胞株中MEPE蛋白表達(dá)水平下調(diào)，而轉(zhuǎn)染相應(yīng)空載體的細(xì)胞株中MEPE蛋白的表達(dá)水平與野生型細(xì)胞株一致，說明腺病毒質(zhì)粒構(gòu)建成功可在真核細(xì)胞表達(dá)。⑵通過劃痕實(shí)驗(yàn)分別在0h與48h觀察轉(zhuǎn)染rAd-4-mMEPE的RWPE1細(xì)胞株、轉(zhuǎn)染rAd-4-siMEPE的PC3細(xì)胞株

4、以及其對(duì)照細(xì)胞株細(xì)胞遷移情況，MEPE蛋白表達(dá)水平高的細(xì)胞株遷移率分別為83％、56%，空載體對(duì)照細(xì)胞遷移率為68%、79%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明MEPE蛋白表達(dá)水平高的細(xì)胞株細(xì)胞遷移能力明顯增強(qiáng)。⑶Transwell實(shí)驗(yàn)觀察到轉(zhuǎn)染rAd-4-mMEPE的RWPE1細(xì)胞株遷移率比對(duì)照細(xì)胞株增加了15%，轉(zhuǎn)染rAd-4-siMEPE的PC3細(xì)胞株遷移率比對(duì)照細(xì)胞株下降了23%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明MEPE蛋白表達(dá)水平高的細(xì)胞株細(xì)胞遷移能力明顯增強(qiáng)。⑷免疫

5、印跡分析結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染rAd-4-mMEPE的RWPE1細(xì)胞株、轉(zhuǎn)染rAd-4-siMEPE的PC3細(xì)胞株以及其對(duì)照細(xì)胞株中PI3K與Rac1的信號(hào)蛋白表達(dá)水平也隨MEPE表達(dá)水平改變而改變。在RWPE1細(xì)胞中其中隨著MEPE蛋白表達(dá)水平增高，PI3K與Rac1表達(dá)水平也升高，在MEPE蛋白表達(dá)水平較低的轉(zhuǎn)染rAd-4-siMEPE的PC3細(xì)胞株與轉(zhuǎn)染空載體的RWPE1細(xì)胞株中，PI3K與Rac1表達(dá)水平較低，actin的表達(dá)水平未見明