沒(méi)藥倍半萜化合物抑制前列腺癌細(xì)胞增殖的作用機(jī)制研究.pdf

1、前列腺癌(prostate callcer，PCa)在歐美國(guó)家的發(fā)病率居男性惡性腫瘤的第二位，在我國(guó)發(fā)病率相對(duì)較低，但近年來(lái)呈上升趨勢(shì)，位于泌尿系腫瘤的第3位。前列腺癌潛伏期長(zhǎng)，惡性程度高，死亡率高，其發(fā)病機(jī)制及生物學(xué)特性復(fù)雜。研究證實(shí)，雄激素受體(Androgen receptor,AR)在前列腺癌的發(fā)生發(fā)展、惡化轉(zhuǎn)移中起重要作用。AR屬于核受體家族，通過(guò)介導(dǎo)雄激素的作用，轉(zhuǎn)錄激活雄激素誘導(dǎo)基因(androgen-inducible

2、genes)的表達(dá)，從而影響前列腺的正常生長(zhǎng)發(fā)育和維持前列腺的正常分泌功能。通常，AR定位在細(xì)胞胞質(zhì)區(qū)，與熱休克蛋白等形成多蛋白無(wú)活性的復(fù)合體。結(jié)合雄激素配體后，AR構(gòu)象改變，與熱休克蛋白解離、磷酸化成為活化的AR進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，其二聚體特異識(shí)別并結(jié)合在雄激素誘導(dǎo)基因調(diào)控區(qū)的雄激素應(yīng)答元件(androgen responsive elements，AREs)上，募集輔助調(diào)節(jié)因子(cofactors)，調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄。在前列腺中，上調(diào)前列

3、腺特異抗原(prostate-specific antigen，PSA)、人激肽釋放酶2(human glandularkallikrein，hk2)表達(dá)[2-4]。對(duì)前列腺癌而言，激素撤除療法是治療晚期前列腺癌的主要方法，但患者通常在治療一年左右后復(fù)發(fā)，前列腺癌不再對(duì)激素敏感，導(dǎo)致激素治療失敗、前列腺癌演變?yōu)榧に胤且蕾囆郧傲邢侔?hormone refractoryprostate cancers，HRPCs)。現(xiàn)已證實(shí)，AR的高表達(dá)

4、、基因突變產(chǎn)生的有功能的突變體以及AR的非激素依賴性激活、AR輔激活因子的過(guò)表達(dá)等造成的AR功能異?；罨菍?dǎo)致PCa發(fā)生、發(fā)展、惡化轉(zhuǎn)移、多藥耐藥的機(jī)理之一[5-6]，也是前列腺癌演變?yōu)榧に胤且蕾囆郧傲邢侔┑姆肿訖C(jī)制，其演變過(guò)程更為復(fù)雜，給臨床的早期診斷和治療帶來(lái)困難。目前，化療是治療HRPCs的主要手段，臨床上的治療藥物各有其作用特點(diǎn)，但效果不佳，因此尋找高效、靶向性強(qiáng)的抗前列腺癌藥物仍然是治療前列腺癌亟待解決的問(wèn)題。其中降低AR的表

5、達(dá)、抑制其功能可能是很效治療靶點(diǎn)之一。 亞洲國(guó)家PCs的低發(fā)病率使科學(xué)家們對(duì)其飲食結(jié)構(gòu)產(chǎn)生興趣，研究證實(shí)，黃酮、多酚類化合物[10]被認(rèn)為是預(yù)防治療PCs很有潛力的藥物。沒(méi)藥(myrrh)為臨床常用鎮(zhèn)痛中藥，目前從沒(méi)藥中已分離鑒定了300多個(gè)化合物，包括萜類、甾體、黃酮、木脂素等化學(xué)成分。最近的研究表明，沒(méi)藥倍半萜成分具有抗腫瘤活性，但其抗腫瘤的分子機(jī)制尚無(wú)深入研究。我們對(duì)分離得到的兩個(gè)吉瑪烷型倍半萜化合物(Germacrane

6、 sesquiterpenoids)，化合物1:1(10)E,2R,4R)-2-甲氧基-8,12-環(huán)氧吉瑪-1(10),7,11-三烯-6-酮(1(10)E,2R,4R)-2-methoxy-8，12-epoxygermacra-1(10),7,11-trien-6-one，簡(jiǎn)稱ST1)，化合物2：2-甲氧基-5-乙酰基-4-呋喃吉瑪-1(10)-烯-6-酮(2-methoxy-5-acetoxy-furanogermacr．-1(10

7、)-en-6-one，簡(jiǎn)稱ST2)進(jìn)行了抗腫瘤活性分析，其中對(duì)前列腺癌細(xì)胞的抑瘤活性較為突出，本文就該類化合物抑制前列腺癌細(xì)胞增殖的作用機(jī)制進(jìn)行了初步探討。 通過(guò)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)首先檢測(cè)ST化合物的抑瘤活性，結(jié)果顯示，ST在較高濃度時(shí)(80μmol/L)對(duì)大腸癌HT29細(xì)胞增殖有顯著的抑制作用，對(duì)前列腺癌激素依賴性細(xì)胞LNCaP、激素非依賴性PC3、PC3M、DU145細(xì)胞在濃度為40μmol/L，時(shí)均有明顯的抑瘤活性。通過(guò)利用肝正

8、常永生化細(xì)胞進(jìn)行化合物毒性檢驗(yàn)，結(jié)果表明ST1在濃度為80μmol/L時(shí)對(duì)正常細(xì)胞有抑制作用。進(jìn)一步利用流式細(xì)胞術(shù)分析ST1化合物對(duì)前列腺癌LNCaP細(xì)胞的細(xì)胞周期變化及細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，兩個(gè)沒(méi)藥倍半萜化合物使S期細(xì)胞明顯減少，細(xì)胞主要停滯于G0/G1期，但沒(méi)有顯著的誘導(dǎo)凋亡作用。通過(guò)反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)、蛋白印跡技術(shù)、細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)分析細(xì)胞周期主要調(diào)控因子之-p21WAF/CIPI及G0/G1期調(diào)控蛋白c

9、yclinD的表達(dá)，結(jié)果表明，ST能在mRNA和蛋白水平誘導(dǎo)p21WAF/CIPI的表達(dá)，同時(shí)降低細(xì)胞周期蛋白cyclinD的表達(dá)，降低cyclinD啟動(dòng)子的表達(dá)活性。從結(jié)果來(lái)看，化合物對(duì)p21WAF/CIPI及cyclinD的影響并不是非常顯者。 由于AR在前列腺癌LNCaP細(xì)胞的增殖中處于關(guān)鍵位置，ST化合物是否通過(guò)影響AR的表達(dá)和功能抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖是我們需要進(jìn)一步探討的問(wèn)題。Westerm Blot結(jié)果顯示，雄激素

10、能非常顯著的誘導(dǎo)AR的表達(dá)，而ST1、ST2均能在雄激素存在的情況下顯著降低AR的表達(dá)、并減少AR向細(xì)胞核定位；熒光素酶活性分析表明，ST能抑制AR啟動(dòng)子的表達(dá)活性；細(xì)胞免疫熒光結(jié)果也證實(shí)ST化合物對(duì)AR表達(dá)的抑制作用。抑制AR功能是抑制細(xì)胞增殖的關(guān)鍵所在，通過(guò)檢測(cè)PSA啟動(dòng)子表達(dá)活性、以及檢測(cè)只含有hk2基因調(diào)控區(qū)中ARE元件的報(bào)告基因表達(dá)活性來(lái)研究AR的轉(zhuǎn)錄激活功能。結(jié)果表明，ST化合物能非常顯著的抑制PSA啟動(dòng)子和hk2-ARE元

11、件報(bào)告基因的表達(dá)活性；另外PSA為分泌蛋白，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液PSA的蛋白水平發(fā)現(xiàn)，雄激素顯著增加PSA蛋白水平，而細(xì)胞經(jīng)ST化合物處理后，PSA蛋白水平顯著降低，表明化合物能顯著抑制AR的轉(zhuǎn)錄激活功能。另外，AR的輔助調(diào)節(jié)因子通過(guò)與AR蛋白間的相互作用直接影響AR的轉(zhuǎn)錄激活功能，我們通過(guò)免疫共沉淀檢測(cè)化合物對(duì)AR與AR輔助激活因子SRC-1和ARA70蛋白間相互作用的影響。結(jié)果顯示，激素顯著加強(qiáng)AR與SRC-1蛋白、ARA70蛋白間的