TRPC6在HGF誘導(dǎo)的前列腺癌細胞增殖中的作用研究.pdf

1、前言：前列腺癌(prostate cancer,PC)的發(fā)病率有明顯的地理及種族差異,歐美地區(qū)發(fā)病率較高,在我國,近年發(fā)病率有明顯增高的趨勢。發(fā)病隱匿、早期的骨和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及表型轉(zhuǎn)換都是前列腺癌預(yù)后差的原因。因此,探索前列腺癌的發(fā)病機制、尋求早期診斷方法和有效的治療手段等三個方面成為前列腺癌研究的熱點和難點。
　　 肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor,HGF)是一種具有多種功能的細胞因子。HGF是由

2、間質(zhì)細胞衍生的細胞因子,通過自分泌或旁分泌的形式作用于數(shù)種上皮源性細胞,HGF/c-MET信號通路即被活化,通過一系列細胞信號通路,例如:促分裂素原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPK)、磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphoinositide3-kinases,P13K.)及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活子(signal transducer and activator of transcrip

3、tion,STAT)等,調(diào)節(jié)細胞分裂、遷移和侵襲,誘導(dǎo)血管形成以及抑制細胞凋亡等,但HGF在調(diào)節(jié)鈣內(nèi)流作用中的機制仍不明確。既往研究發(fā)現(xiàn)前列腺癌患者血漿中的HGF水平與前列腺癌的轉(zhuǎn)移及手術(shù)后復(fù)發(fā)相關(guān),有助于預(yù)測前列腺癌的預(yù)后。
　　 Ca2+做為重要的細胞內(nèi)第二信使,它調(diào)節(jié)細胞的多種生物學(xué)行為,如細胞的增殖、分化和凋亡等,作為Ca2+進入細胞內(nèi)的主要門戶,Ca2+通道在調(diào)節(jié)細胞增殖和細胞周期方面的作用逐漸被人們認(rèn)識。瞬時受體電位

4、通道(transient receptorpotential,TRP)蛋白是一種非選擇性的陽離子通道蛋白,TRPC(transient receptorpotential canonical)作為一種亞家族包括7種亞型,在哺乳動物中廣泛存在,被激活時允許包括Ca2+在內(nèi)的陽離子進行跨膜轉(zhuǎn)運。近期研究發(fā)現(xiàn),TRPC6在肝癌、胃癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤及食管癌等多種惡性腫瘤中呈高表達,且參與調(diào)節(jié)腫瘤細胞的增殖。本課題組通過系統(tǒng)的檢測也證實TRPC6在

5、前列腺癌中高表達,其表達與前列腺癌的組織分級、Gleason評分和前列腺外轉(zhuǎn)移相關(guān)。
　　 既往報道發(fā)現(xiàn)HGF可以誘導(dǎo)腎小管上皮細胞及肝癌細胞中TRPC6基因的表達增多,從而調(diào)節(jié)細胞增殖;也有報道認(rèn)為HGF通過磷脂酶C(phospholipase C,PLC)/二脂酰甘油(diacylglycerol,DAG)途徑激活鼠肝細胞內(nèi)的鈣通道使細胞內(nèi)鈣離子濃度增加。TRPC6的激活機制依賴于PLC信號通路中DAG及三磷酸肌醇(inos

6、itol triphosphate,IP3)的激活,被認(rèn)為是最可能的鈣庫操縱性鈣通道(store-operated calcium channels,SOC)和受體操縱性鈣通道(receptor-operatedcalcium channels,ROC)的分子基礎(chǔ),但在不同細胞中其通道類型及發(fā)揮的作用還存在爭議,且HGF對TRPC6的調(diào)控作用尚需探討。
　　 基于以上研究報告及本課題組既往研究結(jié)果,我們假設(shè):前列腺癌中HGF誘導(dǎo)

7、TRPC6的表達,二者的表達與前列腺癌的進展相關(guān),HGF通過調(diào)控TRPC6介導(dǎo)的鈣內(nèi)流來調(diào)節(jié)前列腺細胞的增殖。我們設(shè)計實驗在臨床病例及前列腺癌細胞中檢測二者之間的表達,探討其可能存在的關(guān)系;在體外檢測前列腺癌細胞中TRPC6通道的功能及生理學(xué)特性,探討TRPC6在HGF誘導(dǎo)的細胞增殖和鈣內(nèi)流中的作用,從生長因子及其受體作用、細胞增殖的調(diào)控及細胞異常增殖時相關(guān)蛋白表達這三個方面來研究HGF及TRPC6在前列腺癌進展中的作用,這對明確HGF

8、誘導(dǎo)細胞增殖的機制,尋找前列腺癌治療及藥物開發(fā)的靶點具有重要意義。
　　 材料與方法：
　　 一、實驗材料
　　 1、細胞株：前列腺癌細胞株LNCaP、22Rv1、Du145及PC3購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所。
　　 2、組織標(biāo)本：收集2008年～2010年手術(shù)或穿刺活檢的前列腺癌38例和良性前列腺增生(benign prostatic hyperplasia,BPH)組織標(biāo)本30例。
　　

9、 二、主要研究方法
　　 1、酶聯(lián)免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)測定血中的HGF含量按照說明書配制檢測所需的標(biāo)準(zhǔn)品及工作液,加入標(biāo)準(zhǔn)品及待測血清,反應(yīng)后棄去板內(nèi)液體,加入生物素抗人HGF抗體工作液,37℃反應(yīng)60min,反復(fù)洗滌后加入親和素-過氧化物酶復(fù)合物(avidin-peroxidase complex,ABC)工作液,反應(yīng)后再次洗滌,先后加入TMB顯色液及終止液

10、,用酶標(biāo)儀在450nm測定OD值,建立曲線,計算HGF濃度。
　　 2、免疫組化檢測HGF及TRPC6在前列腺癌及前列腺增生組織中的表達采用鏈霉素抗生物素蛋白氧化物酶免疫組化法(streptavidin-peroxidaseconjugated method,SP法),標(biāo)本石蠟切片,HGF及TRPC6一抗孵育,4℃過夜,磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution,PBS)緩沖液代替一抗為陰性對照。根據(jù)各標(biāo)記

11、物的反應(yīng)強度按陽性細胞所占細胞數(shù)量百分比與陽性細胞的染色強度進行評分。兩者分值相加最后得分:0～3分為陰性(一),3.5～6分為陽性(+),6.5～8分為強陽性(++)。
　　 3、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcriptase polymerase chainreaction,RT-PCR)檢測TRPC6及c-MET mRNA的表達收集細胞,采用Trizol試劑提取總RNA,檢測純度及含量,反轉(zhuǎn)錄成cDNA,以

12、相應(yīng)的基因引物進行PCR擴增,以β-actin為內(nèi)參照,電泳條帶進行灰度值分析。
　　 4、Western blot檢測蛋白的表達收集細胞提取總蛋白,BCA法檢測蛋白質(zhì)含量。進行聚丙烯酰胺凝膠電泳,轉(zhuǎn)膜,封閉,一抗孵育過夜,相應(yīng)的二抗孵育,增強型化學(xué)發(fā)光(enhancechemiluminescence,ECL),拍照,以β-actin為內(nèi)參照,條帶進行灰度值分析。
　　 5、TRPC6干擾采用小干擾RNA(small

13、interference RNA,siRNA)對TRPC6進行干擾,設(shè)計TRPC6 siRNA序列,使用熒光標(biāo)記質(zhì)粒FAM-siRNA檢測轉(zhuǎn)染效率,根據(jù)篩選出的最佳條件進行RNA干擾,Western blot篩選干擾序列。
　　 6、鈣成像
　　 細胞數(shù)約為1×105/ml播種在共聚焦皿,5μmol/l Fura2-AM37℃孵育,再用HEPES buffer saline孵育1h,在檢測過程中給予1-油?；?2-乙酰甘

14、油(1-oleoyl-2-acetyl-sn-glycerol,OAG)、毒胡蘿卜素(thapsigargin,Tg)及HGF刺激,用熒光倒置顯微鏡檢測并記錄細胞內(nèi)Ca2+濃度的變化。
　　 7、膜片鉗檢測配制電極內(nèi)外液,兩步拉制法制作玻璃微電極,建立千兆歐姆的高電阻封接,再稍加吸引,使電極尖端的膜片破裂,形成whole-cell模式,給予阻抗和電容補償,保持電位-50mV,應(yīng)用(-100～+100)mV,步階10mv的電位進行

15、電流電壓曲線分析,待電流穩(wěn)定后給予藥物刺激,采集電流的變化。
　　 8、細胞增殖實驗調(diào)整細胞濃度為1×105/ml,接種在6孔板中,于24h、48h、72h及96h時收獲細胞,用Codter counter細胞計數(shù)儀計數(shù)細胞并繪出生長曲線。
　　 9、細胞周期檢測制成濃度約為1×107/ml細胞懸液,95％乙醇固定30min,PBS沖洗后用Rnase處理15 min,用碘化丙啶(propidium iodide,PI)染

16、液作用細胞30min,流式細胞儀檢測細胞周期分布。
　　 10、細胞凋亡檢測收集細胞,PBS洗滌,制成濃度約為1×106/ml細胞懸液,加入Annexin V-FITC,再加入PI避光孵育,流式細胞儀檢測。
　　 11、統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件包對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,以P＜0.05為判斷差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)。
　　 結(jié)果：
　　 1、HGF及TRPC6在前列腺癌及前列腺增生組織中的表達組織標(biāo)本免疫組

17、化檢測發(fā)現(xiàn),良性前列腺增生及前列腺癌組織中HGF染色主要集中在間質(zhì)的成纖維細胞及其周圍,而TRPC6染色主要位于增生及癌變的上皮細胞漿及細胞膜上;前列腺癌組織中HGF及TRPC6表達陽性率明顯高于前列腺增組織;進一步的研究發(fā)現(xiàn)HGF及TRPC6的表達與前列腺癌Gleason評分及臨床分期有關(guān),Gleason評分＞7的癌組織中HGF及TRPC6表達高于Gleason評分＜7的癌組織,與T1/T2期腫瘤相比較,T3/T4期腫瘤中HGF及TR

18、PC6表達增高。
　　 2、前列腺癌及前列腺增生患者血漿中HGF濃度與免疫組化檢測結(jié)果相似,ELISA檢測發(fā)現(xiàn),前列腺癌患者血漿中HGF濃度高于較前列腺增生患者,且與前列腺癌Gleason評分及臨床分期有關(guān)。應(yīng)用Spearman秩相關(guān)分析證實前列腺癌組織及血漿中HGF及TRPC6表達呈正相關(guān)。
　　 3、HGF受體c-MET及TRPC6在前列腺癌細胞系中的表達RT-PCR及Western blot檢測c-MET及TRPC

19、6在前列腺癌細胞中的表達。除了LNCaP細胞外,DU145,、PC3及22Rv1均檢測到TRPC6的表達;同時也發(fā)現(xiàn)DU145與PC3表達c-MET;給予HGF刺激后,PC3及DU145細胞中TRPC6表達增多。
　　 4、TRPC6干擾及檢測采用siRNA對TRPC6進行干擾,結(jié)果顯示干擾組1(siRNA1)及干擾組2(siRNA2)細胞中TRPC6表達下降了70％～80％,且所轉(zhuǎn)染的干擾質(zhì)粒特異性的針對TRPC6,不影響TR

20、PC亞型及c-MET在細胞中的表達。
　　 5、TRPC6降表達對細胞增殖、細胞周期及凋亡的影響采用Coulter counter粒子計數(shù)器自動計數(shù)細胞來檢測TRPC6降表達對DU145及PC3細胞增殖的影響。結(jié)果顯示TRPC6降表達后,siRNA1組的細胞增殖受到抑制;G2/M期細胞明顯增多,磷酸化的Tyr15Cdc2明顯增多,但細胞凋亡率無明顯變化。
　　 6、TRPC6降表達對HGF誘導(dǎo)的細胞增殖的影響進一步檢測T

21、RPC6降表達對HGF誘導(dǎo)的細胞增殖的影響,實驗顯示TRPC6降表達后,HGF誘導(dǎo)的前列腺癌細胞的增殖受到抑制,細胞停滯在G2/M期。
　　 7、TRPC6通道功能檢測鈣成像及膜片鉗檢測發(fā)現(xiàn)OAG可以激活TRPC6通道,導(dǎo)致鈣內(nèi)流,使細胞內(nèi)鈣離子濃度升高,Tg不能將其激活;TRPC6通道介導(dǎo)一種非選擇性非電壓依賴性的陽離子電流,既有內(nèi)向電流也有外向電流,反轉(zhuǎn)電位大約在0mV;TRPC6降表達后,OAG誘導(dǎo)的電流減弱。
　　

22、 8、HGF對鈣內(nèi)流的影響HGF作用于DU145細胞后,鈣成像檢測顯示鈣內(nèi)流增加,TRPC6降表達后,HGF誘導(dǎo)的鈣內(nèi)流明顯減弱。
　　 結(jié)論：
　　 1、前列腺癌患者HGF及TRPC6表達明顯高于前列腺增生患者,且與前列腺癌臨床分期和Gleason評分相關(guān);HGF受體c-MET及TRPC6前列腺癌DU145和PC3細胞中表達:HGF上調(diào)DU145和PC3細胞中TRPC6的表達。
　　 2、前列腺癌細胞中TRP