UBE2T促進前列腺癌細胞上皮間質轉化及侵襲轉移的作用機制研究.pdf

1、本研究主要探討UBE2T在前列腺癌中促進前列腺癌細胞增殖、轉移的作用，并深入探討其分子機制。該研究不僅補充了UBE2T在腫瘤中的生物學功能，還進一步完善了其作用機制。同時，也為臨床前列腺癌的診斷和治療提供新的可能靶點。
　　第一部分 E2泛素偶聯(lián)酶UBE2T與前列腺和乳腺腫瘤轉移的相關性究
　　目的：
　　應用前列腺癌、乳腺癌組織芯片研究UBE2T在不同臨床病理分級的前列腺癌和乳腺癌組織中的表達差異，分析UBE2T與前

2、列腺癌、乳腺癌轉移的相關性，為進一步研究UBE2T在腫瘤轉移中的作用打下基礎。
　　方法：
　　1.運用西安艾莉娜生物科技有限公司的前列腺癌組織芯片PR483a，采用免疫組織化學法檢測UBE2T在正常前列腺組織、原位前列腺癌組織和已發(fā)生轉移的原位前列腺癌組織中的表達變化。
　　2.運用西安艾莉娜生物科技有限公司的乳腺癌組織芯片BR1321，采用免疫組織化學法檢測UBE2T在正常前列腺組織，原位前列腺癌組織和已發(fā)生轉移的

3、原位前列腺癌組織中的表達變化。
　　結果：
　　1.采用免疫組織化學法檢測前列腺癌組織芯片中UBE2T的蛋白表達水平，結果表明正常前列腺中UBE2T表達最低，原位前列腺癌中表達較高，而已發(fā)生遠處轉移的原位前列腺癌中UBE2T的表達最為顯著。
　　2.采用免疫組織化學法檢測前列乳癌組織芯片中UBE2T的蛋白表達水平，結果表明正常乳腺中UBE2T表達最低，原位乳腺癌中表達較高，而已發(fā)生遠處轉移的原位乳腺癌中UBE2T的表達

4、最為顯著。
　　3.UBE2T過表達的前列腺癌患者預后生存率明顯降低。
　　結論：
　　1.前列腺癌和乳腺癌組織芯片的免疫組化結果證實UBE2T在已發(fā)生遠處轉移的原位腫瘤組織中表達最為顯著，在原位腫瘤組織中表達低于前者，正常組織中表達最低。這表明UBE2T與腫瘤細胞的侵襲轉移有著密切的相關性。
　　第二部分 UBE2T促進前列腺癌細胞增殖、EMT及侵襲轉移
　　目的：
　　第一部分結果提示UBE2T表

5、達可能與前列腺癌細胞侵襲轉移有關，我們希望通過相應的體外細胞實驗及裸鼠成瘤、轉移模型來驗證UBE2T是否促進前列腺癌細胞的增殖及侵襲轉移。
　　方法：
　　1.采用UBE2T基因過表達質粒pBabe-UBE2T及其對照空白質粒，通過逆轉錄病毒轉染的方法在前列腺癌細胞系Du145和PC3構建UBE2T過表達細胞系及對照細胞系:Du145-pBabe-UBE2T，Du145-pBabe，PC3-pBabe-UBE2T，PC3-p

6、Babe。上述細胞系經2ng/mL嘌呤霉素篩選后，逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)和蛋白免疫印跡實驗(Westem blot)檢測UBE2T的表達改變。
　　2.采用兩個UBE2T基因沉默質粒pSuper-shUBE2T.A和pSuper-shUBE2T.D及對照空白質粒，通過逆轉錄病毒轉染的方法在前列腺癌細胞系Du145和PC3構建UBE2T沉默細胞系及對照細胞系:Du145-pSuper-shUBE2T.A，Du145-pS

7、uper-shUBE2T.D, Du145-pSuper, PC3-pSuper-shUBE2T.D,PC3-pSuper。轉染的細胞系經2ng/mL嘌呤霉素篩選后，RT-PCR和Western blot檢測UBE2T的表達改變。
　　3.應用上述構建的UBE2T過表達或沉默的細胞系，通過MTT和克隆形成檢測UBE2T對腫瘤細胞增殖能力的影響。
　　4.應用上述構建的UBE2T過表達細胞系，顯微鏡下觀察UBE2T對細胞形態(tài)的

8、影響，通過western blot，免疫熒光和免疫組化等方法檢測UBE2T對EMT標志蛋白(E-cadherin，Vimentin，F(xiàn)ibronectin，alpha-smooth muscle acting)表達的影響。
　　5.應用上述構建的UBE2T過表達細胞系，通過劃痕實驗，Transwell小室遷移實驗檢測UBE2T對前列腺癌細胞運動能力的影響;Matrigel侵襲實驗檢測UBE2T對前列腺癌細胞侵襲能力的影響。

9、　　6.應用穩(wěn)定過表達UBE2T的前列腺癌細胞系及其空白對照細胞系，通過皮下注射和尾靜脈注射的方式，建立裸鼠腫瘤生成模型和裸鼠遠處轉移模型，檢測UBE2T對腫瘤生長及遠處轉移的影響。
　　7.應用UBE2T沉默的前列腺癌細胞系及其空白對照細胞系，通過皮下注射和尾靜脈注射的方式，建立裸鼠腫瘤生成模型和裸鼠遠處轉移模型，檢測UBE2T對腫瘤生長及遠處轉移的影響。
　　8.采用免疫組化的方法，檢測瘤體和轉移灶中UBE2T的表達。<

10、br>　　結果：
　　1.成功構建UBE2T過表達前列腺癌細胞系及空白對照細胞系:
　　Du145-pBabe-UBE2T, Du145-pBabe, PC3-pBabe-UBE2T, PC3-pBabe。
　　2.成功構建UBE2T沉默前列腺啊細胞系及空白對照細胞系:Du145-pSuper-shUBE2T.A, Du145-pSuper-shUBE2T.D, Du145-pSuper,PC3-pSuper-shUB

11、E2T.D, PC3-pSuper。
　　3.過表達UBE2T促進前列腺癌細胞的增殖，同時沉默UBE2T能夠抑制前列腺癌細胞的生長速度。
　　4.UBE2T促使前列腺癌細胞由上皮細胞形態(tài)向間質細胞形態(tài)變化。
　　5.過表達UBE2T能夠促進前列腺癌細胞間質分子標志物(Vimentin，F(xiàn)ibronectin，alpha-SMA)的表達，抑制上皮分子標志物(E-cadherin)的表達。
　　6.UBE2T能夠促進

12、前列腺癌細胞體外遷移和侵襲轉移能力。
　　7.裸鼠成瘤實驗證明UBE2T促進前列腺腫瘤的生長。
　　8.裸鼠轉移模型實驗表明UBE2T能夠促進前列腺癌細胞的體內侵襲轉移能力。
　　結論：
　　1.UBE2T能夠促進前列腺癌細胞的增殖。
　　2.UBE2T具有調控前列腺癌細胞EMT及體外遷移、侵襲轉移的能力。
　　3.UBE2T能夠促進前列腺癌細胞體內增殖和侵襲轉移。
　　第三部分 UBE2T促進

13、前列腺癌細胞EMT及侵襲轉移的分子機制究
　　目的：
　　體外實驗證明UBE2T能夠促進前列腺癌細胞的增殖、遷移及侵襲轉移，但是其作用機制尚不明確，該部分目的在于通過一系列實驗探討UBE2T可能的分子機制。
　　方法：
　　1.串聯(lián)親和質譜分析(Tandem affinity purification and Mass Spectrometry，TAP-MS)檢測可能與UBE2T相結合的蛋白。
　　2.利用

14、前列腺癌組織芯片檢測UBE2T與靶蛋白Vimentin之間的相關性。
　　3.通過western blot實驗，檢測在放線菌酮(CHX)作用下UBE2T對Vimentin蛋白半衰期的影響
　　4.利用上述方法檢測另一靶向Vimentin的分子FBXW7對Vimentin半衰期的影響。
　　5.通過免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation，Co-IP實驗，分析UBE2T、FBXW7和Vimentin三者之

15、間的相互作用。
　　6.通過western blot實驗，驗證UBE2T和FBXW7是否共同影響Vimentin的蛋白水平。
　　7.通過Co-IP檢測UBE2T能夠影響FBXW7和Vimentin之間的結合及FBXW7對Vimentin的降解。
　　8.通過系列點突變、Co-IP等試驗，分析UBE2T第95位氨基酸是否是UBE2T與Vimentin的結合位點。
　　9.將UBE2T第95位氨基酸突變成同性質的其

16、他氨基酸，檢測突變后的UBE2T對前列腺啊細胞增殖，遷移及侵襲轉移的影響。
　　結果：
　　1.TAP-MS、蛋白半衰期等試驗結果發(fā)現(xiàn)Vimentin是UBE2T可能的靶蛋白之一。
　　2.組織芯片結果表明在前列腺癌組織中UBE2T的表達水平與Vimentin的表達正相關。
　　3.UBE2T能夠延緩Vimentin的降解，而FBXW7能夠促進Vimentin的降解。
　　4.UBE2T能夠抑制FBXW7所

17、引起的Vimentin的降解。
　　5.UBE2T能夠影響FBXW7與Vimentin之間的結合，從而影響Vimentin的表達。
　　6.UBE2T第95位的氨基酸是UBE2T與Vimentin的結合位點。
　　7.UBE2T第95位氨基酸突變能夠抑制UBE2T促進前列腺癌細胞增殖，遷移及侵襲轉移的作用。
　　結論：
　　1.Vimentin是UBE2T的靶蛋白，UBE2T能夠延緩Vimentin的降解。