BDNF-TrkB通路對(duì)前列腺癌細(xì)胞上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化、遷移、侵襲、失巢凋亡的影響及分子機(jī)制的體外研究.pdf

1、第一部分人前列腺細(xì)胞失巢凋亡耐受模型的建立及其生物學(xué)特性的研究
　　目的:建立人前列腺癌細(xì)胞失巢凋亡耐受模型，觀察其生物學(xué)特性的改變。
　　方法:Western blot及qRT-PCR檢測(cè)前列腺癌細(xì)胞系LNCaP，PC3，PC3M，DU145的TrkB（受體酪氨酸激酶B）及其配體BDNF（腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子）表達(dá)情況。隨后我們選擇PC3，DU145細(xì)胞進(jìn)行失巢凋亡耐受模型的建立。PC3，DU145細(xì)胞在ULC培養(yǎng)板懸浮培養(yǎng)

2、7天后，將細(xì)胞重新貼壁培養(yǎng)，待細(xì)胞擴(kuò)增后，再將細(xì)胞轉(zhuǎn)入U(xiǎn)LC培養(yǎng)板繼續(xù)懸浮培養(yǎng)7天后，存活的細(xì)胞繼續(xù)貼壁培養(yǎng)，以誘導(dǎo)獲得失巢凋亡耐受PC3，DU145細(xì)胞。Transwell實(shí)驗(yàn)及軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)親本細(xì)胞及失巢凋亡耐受細(xì)胞的遷移、侵襲及錨定非依賴性生長(zhǎng)能力。Western Blot及Real-Time PCR檢測(cè)親本細(xì)胞及失巢凋亡耐受細(xì)胞TrkB和BDNF表達(dá)水平的變化。
　　結(jié)果:1.上述所有前列腺癌細(xì)胞系均表達(dá)Trk

3、B，除了LNCaP細(xì)胞不表達(dá)BDNF外，其余前列腺癌細(xì)胞均表達(dá)BDNF。
　　2.失巢凋亡耐受PC3，DU145細(xì)胞的遷移、侵襲及錨定非依賴性生長(zhǎng)能力均顯著高于親本細(xì)胞。
　　3.失巢凋亡耐受PC3，DU145細(xì)胞的TrkB mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯高于親本細(xì)胞，而BDNF mRNA及蛋白表達(dá)水平無明顯差異。
　　結(jié)論:前列腺癌細(xì)胞系表達(dá)不同水平的TrkB及BDNF。采用ULC培養(yǎng)板懸浮培養(yǎng)后重貼壁的方法成功構(gòu)建出失

4、巢凋亡耐受前列腺癌細(xì)胞。誘導(dǎo)獲得的失巢凋亡耐受PC3，DU145細(xì)胞的錨定非依賴性生長(zhǎng)、遷移和侵襲能力均顯著高于親本細(xì)胞，并且其TrkB表達(dá)水平明顯升高。
　　第二部分 BDNF/TrkB通路對(duì)人前列腺癌細(xì)胞上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化、遷移、侵襲及失巢凋亡的影響的體外研究
　　目的:研究BDNF/TrkB通路對(duì)不同前列腺癌細(xì)胞系上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化、遷移、侵襲及失巢凋亡的影響。
　　方法:用siRNA敲低失巢凋亡耐受細(xì)胞TrkB的表達(dá)，

5、采用流式細(xì)胞術(shù)及Transwell小室實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞遷移、侵襲及抗失巢凋亡能力的變化。采用流式細(xì)胞術(shù)及Transwell小室實(shí)驗(yàn)評(píng)估rhBDNF及酪氨酸激酶受體拮抗劑K252a對(duì)不同前列腺癌細(xì)胞失巢凋亡、遷移、侵襲的影響。使PC3細(xì)胞穩(wěn)定過表達(dá)TrkB，采用流式細(xì)胞術(shù)、CCK-8、軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)以及Transwell小室實(shí)驗(yàn)評(píng)估轉(zhuǎn)染細(xì)胞抗失巢凋亡能力、非錨定依賴性生長(zhǎng)能力以及遷移、侵襲能力的變化，倒置相差顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。

6、
　　結(jié)果:1.用siRNA敲低TrkB的表達(dá)后，能抑制失巢凋亡耐受前列腺癌細(xì)胞的遷移、侵襲及抗失巢凋亡能力。
　　2.外源性BDNF的刺激能促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的遷移、侵襲，抑制前列腺癌細(xì)胞的失巢凋亡，而酪氨酸激酶受體拮抗劑K252a能抑制上述作用。
　　3.穩(wěn)定過表達(dá)TrkB能抑制PC3細(xì)胞失巢凋亡，促進(jìn)PC3細(xì)胞錨定非依賴性生長(zhǎng)，促進(jìn)血清誘導(dǎo)或BDNF誘導(dǎo)的PC3細(xì)胞遷移、侵襲，以及使PC3細(xì)胞形態(tài)發(fā)生上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化

7、樣改變。
　　結(jié)論:BDNF/TrkB通路能介導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞EMT的發(fā)生、抑制前列腺癌細(xì)胞的失巢凋亡、促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞遷移及侵襲。BDNF/TrkB通路參與了多階段的前列腺癌進(jìn)展過程，并在其中發(fā)揮重要作用。
　　第三部分 BDNF/TrkB通路介導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化、遷移、侵襲及失巢凋亡耐受的分子機(jī)制的研究
　　目的:研究BDNF/TrkB通路介導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）、遷移、侵襲及失巢凋亡耐受的

8、分子機(jī)制。
　　方法:1.比較親本細(xì)胞及失巢凋亡耐受前列腺癌細(xì)胞AKT及ERK通路激活情況，用siRNA敲低失巢凋亡耐受前列腺癌細(xì)胞TrkB表達(dá)，觀察AKT及ERK通路激活情況。
　　2.以外源性BDNF及K252a為處理因素，Western Blot檢測(cè)不同處理因素對(duì)前列腺癌細(xì)胞AKT、p-AKT、ERK、p-ERK、MMP9蛋白表達(dá)的影響，以及對(duì)懸浮培養(yǎng)狀態(tài)下Cleaved caspase3蛋白表達(dá)的影響。
　　3

9、. Western Blot檢測(cè)穩(wěn)定過表達(dá)TrkB的PC3細(xì)胞的AKT、p-AKT、ERK、p-ERK、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Snail、Twist、Slug、MMP9蛋白表達(dá)的變化，以及在懸浮培養(yǎng)狀態(tài)下Cleaved caspase3蛋白表達(dá)的變化。
　　4.觀察AKT拮抗劑MK2206對(duì)BDNF/TrkB通路介導(dǎo)的前列腺癌細(xì)胞遷移、侵襲及失巢凋亡耐受的影響。
　　結(jié)果:1. AKT

10、及ERK通路在失巢凋亡耐受前列腺癌細(xì)胞中被顯著激活，而瞬時(shí)敲低失巢凋亡耐受前列腺癌細(xì)的TrkB表達(dá)能抑制AKT及ERK通路的激活，并促進(jìn)懸浮培養(yǎng)狀態(tài)下Cleaved caspase3的產(chǎn)生。
　　2.外源性BDNF的刺激能上調(diào)前列腺癌細(xì)胞p-AKT、p-ERK、MMP9的表達(dá)水平，抑制懸浮培養(yǎng)狀態(tài)下Cleaved caspase3的產(chǎn)生，而K252a能抑制上述作用。
　　3. PC3細(xì)胞穩(wěn)定過表達(dá)TrkB后，其p-AKT、p

11、-ERK、N-cadherin、Vimentin、Snail、Twist、MMP9的表達(dá)水平上調(diào)，E-cadherin表達(dá)水平下降，懸浮培養(yǎng)狀態(tài)下Cleaved caspase3的產(chǎn)生減少。
　　4. AKT抑制劑MK2206能抑制BDNF/TrkB通路介導(dǎo)的前列腺癌細(xì)胞遷移、侵襲及失巢凋亡耐受。
　　結(jié)論: BDNF/TrkB通路通過調(diào)節(jié)多種蛋白表達(dá)從而介導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞EMT發(fā)生，抑制前列腺癌細(xì)胞的失巢凋亡，及促進(jìn)前列腺癌