MicroRNA調(diào)控上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的機(jī)制及其對鼻咽癌細(xì)胞侵襲和遷移的影響.pdf

1、目的：
　　1.研究鼻咽癌耐藥細(xì)胞株的相關(guān)特性、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)表型，初步探討EMT與鼻咽癌耐藥、轉(zhuǎn)移的關(guān)系。
　　2.研究鼻咽癌耐藥細(xì)胞中microRNAs（miRNAs）的變化，并進(jìn)一步篩選和驗(yàn)證差異表達(dá)的miRNA。
　　3.探討miRNA調(diào)控EMT的機(jī)制及其對鼻咽癌細(xì)胞侵襲和遷移的影響。
　　方法：
　　1. MTT法探討不同濃度的順鉑(DDP)作用于鼻咽癌細(xì)胞 HNE1，HNE1/DD

2、P24、48、72h后對細(xì)胞存活率的影響，以明確其劑量-效應(yīng)關(guān)系和耐藥指數(shù)；細(xì)胞生長情況采用不同時(shí)間（24、48、72、96、120、144、168h）計(jì)算鼻咽癌細(xì)胞HNE1、HNE1/DDP的細(xì)胞數(shù)目；利用Western blot檢測鼻咽癌細(xì)胞HNE1、HNE1/DDP中 MRP、Mcl-1、Bcl-2、Bax、Puma的蛋白表達(dá)水平；利用熒光定量 RT-PCR檢測鼻咽癌細(xì)胞 HNE1、HNE1/DDP中 MDR1、MRP、Bcl-2

3、、Bax的mRNA變化。
　　2.采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測鼻咽癌細(xì)胞 HNE1、HNE1/DDP的遷移能力；利用transwell小室作細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)與重組基底膜侵襲實(shí)驗(yàn)檢測鼻咽癌細(xì)胞 HNE1、HNE1/DDP在體外遷移與侵襲能力；倒置光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)特征；利用Western blot檢測鼻咽癌細(xì)胞HNE1，HNE1/DDP中EMT相關(guān)蛋白E-cadherin、β-catenin、Vimentin、Fibronectin、MMP

4、-9及轉(zhuǎn)錄因子Snail、Slug、Twist、ZEB1的表達(dá)；利用熒光定量RT-PCR檢測鼻咽癌細(xì)胞HNE1，HNE1/DDP中EMT相關(guān)標(biāo)志E-cadherin、β-catenin、Vimentin、Fibronectin、MMP-9及轉(zhuǎn)錄因子Snail、Slug、Twist、ZEB1的mRNA變化。
　　3. MicroRNA（miRNA）芯片技術(shù)檢測鼻咽癌細(xì)胞HNE1、HNE1/DDP中 miRNAs表達(dá)變化，并進(jìn)一步篩選

5、差異表達(dá)的miRNA；熒光定量 RT-PCR驗(yàn)證其差異表達(dá)的miRNA；利用 Western blot和熒光定量 RT-PCR檢測鼻咽癌細(xì)胞 HNE1、HNE1/DDP中HIF-1α的表達(dá)水平。
　　4.將miRNA的模擬物（mimics）和抑制劑（inhibitors）轉(zhuǎn)染進(jìn)入鼻咽癌細(xì)胞中，熒光定量RT-PCR檢測miRNA的變化，細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力的變化， Transwell小室法檢測細(xì)胞的侵襲和遷移能力變化，利用W

6、estern blot和熒光定量RT-PCR檢測EMT相關(guān)標(biāo)志E-cadherin、Vimentin、MMP-9的變化，倒置光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)特征。
　　5.預(yù)測miRNA的潛在靶基因，利用Western blot和熒光定量RT-PCR檢測調(diào)控miRNA對靶基因的影響；轉(zhuǎn)染小干擾RNA，熒光定量RT-PCR檢測mRNA的變化，細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力的變化，Transwell小室法檢測細(xì)胞的侵襲和遷移能力變化，倒置光學(xué)顯微

7、鏡觀察細(xì)胞形態(tài)特征，Western blot和熒光定量RT-PCR檢測EMT相關(guān)標(biāo)志E-cadherin、Vimentin、MMP-9的變化。
　　結(jié)果：
　　1.鼻咽癌細(xì)胞HNE1/DDP對DDP具有耐藥的特性
　　(1) MTT法顯示：不同濃度的DDP(2、4、8、16、32μmol·L-1)在24、48、72h抑制鼻咽癌細(xì)胞HNE1、HNE1/DDP的增殖，且隨著DDP濃度的增加抑制作用增強(qiáng)。鼻咽癌細(xì)胞HNE1/

8、DDP、HNE1在24、48、72h的半數(shù)抑制率(IC50)分別是29.04±2.82、19.44±1.77、11.39±1.89μmol·L-1和6.84±1.59、4.25±0.36、2.35±0.96μmol·L-1及其耐藥指數(shù)(RI)分別為4.25、4.57、4.85，HNE1/DDP細(xì)胞相對于HNE1細(xì)胞對DDP不敏感，且在正常培養(yǎng)條件下，HNE1/DDP細(xì)胞相對于HNE1細(xì)胞生長緩慢。
　　(2) Western bl

9、ot結(jié)果顯示：HNE1/DDP細(xì)胞與HNE1細(xì)胞相比，MRP、Mcl-1、Bcl-2表達(dá)升高，但 Bax、Puma表達(dá)下降。熒光定量 RT-PCR結(jié)果顯示：在HNE1/DDP細(xì)胞中， MDR1、MRP、Bcl-2表達(dá)上調(diào)和Bax表達(dá)下調(diào)。
　　2. HNE1/DDP細(xì)胞增加侵襲和遷移的潛能，并誘發(fā)EMT
　　(1)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HNE1/DDP細(xì)胞與HNE1細(xì)胞相比具有較強(qiáng)的遷移能力。Transwell小室法結(jié)果顯示

10、，HNE1/DDP細(xì)胞相對于HNE1細(xì)胞的體外遷移和侵襲能力明顯增強(qiáng)。
　　(2)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)特征，HNE1細(xì)胞是細(xì)胞與細(xì)胞連接、集落生長、圓形、沒有偽足形成，類似于上皮樣；相對而言，HNE1/DDP細(xì)胞是細(xì)胞與基質(zhì)連接、狹長、分散性生長、有偽足形成，類似于間質(zhì)樣。
　　(3) Western blot和熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示，HNE1/DDP細(xì)胞中上皮標(biāo)志分子（如E-cadherin、β-catenin）的表

11、達(dá)明顯低于HNE1細(xì)胞，而HNE1/DDP細(xì)胞中間質(zhì)標(biāo)志分子（如Vimentin、Fibronectin、MMP-9）的表達(dá)明顯高于HNE1細(xì)胞。此外，HNE1/DDP細(xì)胞中EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Snail、Slug、Twist、ZEB1的表達(dá)明顯高于HNE1細(xì)胞。
　　3.鼻咽癌細(xì)胞中miRNA的表達(dá)
　　MiRNA芯片結(jié)果顯示，HNE1/DDP細(xì)胞與HNE1細(xì)胞相比有18種miRNAs表達(dá)上調(diào)和9種miRNAs表達(dá)下調(diào)。在這

12、些miRNAs中，miR-10b是最具有差異表達(dá)的miRNA。在HNE1/DDP細(xì)胞與HNE1細(xì)胞相比中，熒光定量RT-PCR驗(yàn)證miR-10b具有25倍上調(diào)。同時(shí)，Western blot和熒光定量 RT-PCR結(jié)果顯示， HNE1/DDP細(xì)胞中HIF-1α的表達(dá)明顯高于HNE1細(xì)胞。
　　4. MiR-10b調(diào)控EMT及其對鼻咽癌細(xì)胞侵襲和遷移的影響
　　(1)表達(dá) miR-10b的HNE1細(xì)胞轉(zhuǎn)染 miR-10b的模擬

13、物，高表達(dá) miR-10b的HNE1/DDP細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-10b抑制劑。熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示，miR-10b模擬物能升高miR-10b的表達(dá)，而miR-10b抑制劑能抑制miR-10b的表達(dá)。
　　(2)劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示， miR-10b模擬物能明顯增強(qiáng) HNE1細(xì)胞遷移能力， miR-10b抑制劑降低HNE1/DDP細(xì)胞遷移能力。此外，Transwell小室法結(jié)果顯示，miR-10b模擬物能明顯增加HNE1細(xì)胞的遷移和

14、侵襲細(xì)胞數(shù)，miR-10b抑制劑減少HNE1/DDP細(xì)胞的遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)。
　　(3) Western blot和熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示，miR-10b模擬物能使HNE1細(xì)胞中E-cadherin減少和Vimentin、MMP-9增加，miR-10b抑制劑能使HNE1/DDP細(xì)胞中E-cadherin增加和Vimentin、MMP-9減少。顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)特征， miR-10b模擬物能使HNE1細(xì)胞中出現(xiàn)更多的間質(zhì)樣細(xì)

15、胞，miR-10b抑制劑能使HNE1/DDP細(xì)胞從間質(zhì)樣梭形細(xì)胞轉(zhuǎn)化為上皮樣細(xì)胞。
　　5. MiR-10b通過介導(dǎo)KLF4和Notch1對鼻咽癌細(xì)胞EMT的調(diào)控作用
　　(1)采用miRTarBase軟件預(yù)測miR-10b的靶基因，其中KLF4和Notch1選作進(jìn)一步研究。Western blot和熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示，HNE1/DDP細(xì)胞中KLF4的表達(dá)明顯低于HNE1細(xì)胞，但Notch1的表達(dá)高于HNE1細(xì)胞。

16、
　　(2) Western blot結(jié)果顯示，miR-10b模擬物能使HNE1細(xì)胞中KLF4減少，miR-10b抑制劑能使 HNE1/DDP細(xì)胞中 KLF4增加。但熒光定量 RT-PCR結(jié)果顯示， miR-10b的過表達(dá)或抑制對KLF4沒有影響。Western blot和熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示，miR-10b模擬物能使HNE1細(xì)胞中Notch1增加，而miR-10b抑制劑能使HNE1/DDP細(xì)胞中Notch1減少。

17、　　(3)將鼻咽癌細(xì)胞HNE1/DDP轉(zhuǎn)染Notch1 siRNA和對照siRNA，培養(yǎng)48h后， western blot和qRT-PCR檢測Notch1表達(dá)減少。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Notch1 siRNA能明顯減少 HNE1/DDP細(xì)胞的遷移能力。此外，Transwell小室法結(jié)果顯示， Notch1 siRNA能明顯減少HNE1/DDP細(xì)胞的遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)。
　　(4)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)特征，Notch1 siRNA能使

18、HNE1/DDP細(xì)胞從間質(zhì)樣梭形細(xì)胞轉(zhuǎn)化為上皮樣細(xì)胞。Western blot和熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示，Notch1 siRNA能使HNE1/DDP細(xì)胞中E-cadherin增加和Vimentin、MMP-9減少。
　　結(jié)論：
　　1.順鉑耐藥鼻咽癌細(xì)胞具有耐藥的特性，進(jìn)而誘發(fā)EMT變化且增加侵襲和遷移的潛能。
　　2.多個(gè)miRNA在鼻咽癌細(xì)胞中差異表達(dá)，可能在順鉑耐藥和EMT中起重要作用。
　　3.過表