前列腺癌中高表達(dá)的CtBP2基因?qū)?xì)胞增殖的影響.pdf

1、目的：探討CtBP2在前列腺癌及良性前列腺增生組織中的表達(dá)狀況，并確定其與臨床病理特征及患者預(yù)后的關(guān)系。再運(yùn)用短發(fā)卡RNA(shRNA)干擾技術(shù)沉默前列腺癌細(xì)胞中的CtBP2基因，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。進(jìn)一步研究靶向沉默CtBP2后細(xì)胞增殖能力的變化。
　　 方法：⑴應(yīng)用免疫組織化學(xué)法（SABC法）檢測(cè)CtBP2在160例前列腺癌組織和60例良性前列腺增生組織中的表達(dá)情況，并與Gleason評(píng)分、臨床分期等臨床病理特征進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分

2、析。結(jié)合免疫組化研究結(jié)果及患者臨床隨診資料，對(duì)它們之間的關(guān)系進(jìn)行Kaplan-Meier生存分析及多變量Cox回歸分析。⑵利用qPCR和Western-blot篩選出CtBP2表達(dá)水平最高的前列腺癌細(xì)胞系作為研究對(duì)象。經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)分別將三個(gè)針對(duì)不同位點(diǎn)的CtBP2-shRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入CtBP2表達(dá)最高的前列腺癌細(xì)胞系中，通過(guò)RT-PCR及Western印跡法篩選出干擾效果最佳的質(zhì)粒。⑶經(jīng)嘌呤霉素篩選及克隆化培養(yǎng)后獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CtB

3、P2-shRNA的細(xì)胞株。應(yīng)用qPCR和Western印跡法分別檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞中CtBP2在mRNA以及蛋白水平的表達(dá)情況。⑷運(yùn)用細(xì)胞計(jì)數(shù)法、細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)及MTT法檢測(cè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CtBP2-shRNA真核表達(dá)載體前后前列腺癌細(xì)胞的增殖能力。
　　 結(jié)果：①通過(guò)免疫組化分析發(fā)現(xiàn)，在前列腺癌組織中CtBP2蛋白高表達(dá)率為86％(138/160)，表達(dá)水平較良性前列腺增生組織顯著升高（P＜0.05）;CtBP2的表達(dá)與腫瘤臨床分期

4、(P=0.025)、Gleason評(píng)分(P=0.019)及PSA水平（P=0.018）密切相關(guān)。通過(guò)Kaplan-Meier生存分析發(fā)現(xiàn)CtBP2的表達(dá)水平與前列腺癌患者生存時(shí)間顯著負(fù)相關(guān)（P=0.027）。多變量Cox回歸分析顯示CtBP2表達(dá)水平是患者預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子(P=0.043)。②采用qPCR和Western blot方法檢測(cè)了正常前列腺上皮細(xì)胞（RWPE-1）、PC3、LNCaP3個(gè)細(xì)胞系中CtBP2的表達(dá)水平，結(jié)果顯示

5、其表達(dá)水平高低順序依次為RWPE-1＜LNCaP＜PC3。將CtBP2-shRNA表達(dá)載體成功轉(zhuǎn)染入PC3細(xì)胞，靶向838-857位點(diǎn)干擾質(zhì)粒1(CtBP2-shRNA-1)比干擾質(zhì)粒2和3具有更強(qiáng)的CtBP2基因沉默效應(yīng)(P＜0.05)。成功建立穩(wěn)定表達(dá)CtBP2-shRNA-1的PC3細(xì)胞系。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后PC3細(xì)胞中CtBP2在mRNA以及蛋白水平的表達(dá)較轉(zhuǎn)染前明顯降低(P＜0.05)。③細(xì)胞計(jì)數(shù)及MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Silence組（

6、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CtBP2-shRNA-1真核表達(dá)載體的PC3細(xì)胞）與Vector組（穩(wěn)定轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒PC3細(xì)胞）、Blank control組（正常PC3細(xì)胞）相比較，其增殖水平于培養(yǎng)第2天開(kāi)始有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖水平降低(P＜0.05)。④細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Blank Control組、Vector組和Silence組PC3細(xì)胞培養(yǎng)12天后可見(jiàn)克隆數(shù)分別為136±11、128±12和56±9，Silence組細(xì)胞克隆形成直徑明顯

7、小于其他兩組，Silence組PC3細(xì)胞的集落形成抑制率達(dá)到了59.8％。
　　 結(jié)論：前列腺癌組織中CtBP2高表達(dá)，并與前列腺癌的高Gleason評(píng)分、高臨床分期、高PSA水平以及患者不良預(yù)后密切相關(guān)。靶向CtBP2 mRNA838-857位點(diǎn)的干擾質(zhì)粒能夠有效的在轉(zhuǎn)錄后水平抑制前列腺癌細(xì)胞CtBP2基因的表達(dá)，并使前列腺癌細(xì)胞增殖能力明顯下降。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明CtBP2表達(dá)增加與前列腺癌惡性生物學(xué)行為相關(guān)，是前列腺癌發(fā)生進(jìn)