Ankyrin-B基因“死亡”結(jié)構(gòu)域突變在4型QT間期延長綜合征中的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、QT間期延長綜合征(LQTS)是以心電圖QT間期延長為主要特征的一種遺傳性心律失常。其主要原因是心臟的延遲復(fù)極。患者易出現(xiàn)陣發(fā)性的尖端扭轉(zhuǎn)型室性心動過速(TDP)、心室纖顫，甚至導(dǎo)致暈厥和猝死。而且，具有家族性遺傳基因的年輕人常因此而出現(xiàn)心源性休克，其病死率較高。
　　 目前研究表明，LQTS根據(jù)病因及發(fā)病機(jī)制可分為LQT1-12及JLN1-2共14種。LQT4的發(fā)病機(jī)制與發(fā)生在染色體4q25-27上的ankyrin-B基因突變

2、導(dǎo)致該基因編碼的ankyrin-B蛋白（ANKB）出現(xiàn)功能異常直接相關(guān)。ANKB是心血管系統(tǒng)中離子通道和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白信號復(fù)合物的關(guān)鍵部位，結(jié)構(gòu)上可以分為膜結(jié)合結(jié)構(gòu)域、血影結(jié)合結(jié)構(gòu)域、羧基端結(jié)構(gòu)域和“死亡”結(jié)構(gòu)域，而羧基端結(jié)構(gòu)域和“死亡”結(jié)構(gòu)域又合稱為調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域。研究表明，1型Na+-Ca2+交換器(NCX1)、Na+-K+-ATP酶α1/α2（Na+/K+ATPα1/α2）和三磷酸肌醇受體(IP3R)是ANKB的結(jié)合蛋白，ankyrin-B

3、基因突變所致的功能障礙是導(dǎo)致室性心動過速，甚至猝死以及病竇綜合征等一系列復(fù)雜的心電紊亂表型的主要原因。近來，大量的動物模型研究還發(fā)現(xiàn)，ANKB在維持正常心功能中發(fā)揮著極其重要的作用。迄今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的ankyrin-B基因堿基點(diǎn)突變絕大多數(shù)發(fā)生在該基因羧基端結(jié)構(gòu)域和血影蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域，而“死亡”結(jié)構(gòu)域的點(diǎn)突變鮮有報道。本課題前期臨床研究發(fā)現(xiàn)一例LQT4患者，其ankyrin-B基因的點(diǎn)突變位于“死亡”結(jié)構(gòu)域（第40號外顯子）的第460

4、3號堿基突變，即胸腺嘧啶取代了腺嘌呤(T4603A)，導(dǎo)致第1535號氨基酸發(fā)生改變，即精氨酸取代了色氨酸(W1535R)，作為調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域組成部分的“死亡”結(jié)構(gòu)域點(diǎn)突變導(dǎo)致LQT4的發(fā)生機(jī)制尚不清楚。因此，在本研究旨在于探討ankyrin-B基因“死亡”結(jié)構(gòu)域點(diǎn)突變(ANKB-W1535R)導(dǎo)致LQT4的分子生物學(xué)機(jī)制。
　　 本實(shí)驗(yàn)分三部分。第一部分:確定心肌組織腺病毒在體轉(zhuǎn)染方法的有效性。實(shí)驗(yàn)分為陰性對照組(groupⅠ)、

5、心肌多點(diǎn)注射組(groupⅡ)、傳統(tǒng)冠脈灌注組(groupⅢ)和停搏后冠脈灌注組(groupⅣ)。按照上述各方法轉(zhuǎn)染后，觀察各組轉(zhuǎn)染效率的差異，并通過組織學(xué)方法觀察心肌組織形態(tài)改變，Westernblot法檢測各組心外組織（肝、腎、肺）中腺病毒的表達(dá)量，以及停搏后冠脈灌注組心肌組織中腺病毒表達(dá)量隨時間變化的關(guān)系。
　　 第二部分:在大體水平探討轉(zhuǎn)染ankyrin-B基因“死亡”結(jié)構(gòu)域點(diǎn)突變(ANKB-W1535R)對大鼠心電及相

6、關(guān)蛋白表達(dá)的影響。實(shí)驗(yàn)分為陰性對照組(control)、轉(zhuǎn)染Ad-EGFP組(EGFP組)和轉(zhuǎn)染Ad-EGFP-ANKB-W1535R(ANKB-W1535R組)。運(yùn)用停搏后冠脈灌注法建立大鼠LQT4模型，觀察ANKB-W1535R對大鼠心電圖的影響;Western blot方法檢測ANKB-W1535R對大鼠心肌組織的ANKB蛋白及其結(jié)合蛋白Na+/K+ATPα1/α2、NCX1和IP3R蛋白表達(dá)量的影響。
　　 第三部分:在

7、細(xì)胞水平研究轉(zhuǎn)染ankyrin-B基因“死亡”結(jié)構(gòu)域點(diǎn)突變(ANKB-W1535R)對大鼠心肌細(xì)胞Ca2+瞬變及相關(guān)蛋白表達(dá)和定位的影響。急性分離大鼠心肌細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分為陰性對照組(control)、轉(zhuǎn)染Ad-EGFP組(EGFP組)和轉(zhuǎn)染Ad-EGFP-ANKB W1535R(ANKB-W1535R組)，并通過細(xì)胞免疫熒光方法觀察ANKB-W1535R對心肌細(xì)胞ANKB蛋白及其結(jié)合蛋白Na+/K+ATPα1/α2、NCX1和IP3R蛋白

8、表達(dá)量及定位的影響。
　　 結(jié)果
　　 第一部分:確定心肌組織腺病毒在體轉(zhuǎn)染方法的有效性
　　 （一）各組大鼠心肌組織EGFP熒光強(qiáng)度及轉(zhuǎn)染效率的比較
　　 熒光顯微鏡下陰性對照組心肌組織可見微弱的自發(fā)熒光。轉(zhuǎn)染各組4日后大鼠心肌組織均有明顯的綠色熒光，其中心肌多點(diǎn)注射組熒光分布不均，傳統(tǒng)冠脈灌注組僅有點(diǎn)片狀熒光，停搏后冠脈灌注組熒光均勻分布。傳統(tǒng)冠脈灌注組轉(zhuǎn)染效率最低(5.29±4.9％)，分別與心肌多

9、點(diǎn)注射組(61.9±9.7％)和停搏后冠脈灌注組(52.9±7.4％)相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，而心肌多點(diǎn)注射組與停搏后冠脈灌注組的轉(zhuǎn)染效率相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。
　　 （二）各組EGFP在左心室表達(dá)量的比較
　　 采用Western Blot分析各組EGFP在左心室的表達(dá)量，心肌多點(diǎn)注射組及停搏后冠脈灌注組的EGFP表達(dá)量顯著強(qiáng)于傳統(tǒng)冠脈灌注組(P＜0.01)，而心肌多點(diǎn)注射組及停搏后冠脈灌

10、注組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 （三）各組大鼠心臟及心外組織（腎臟、肝臟、肝臟）中EGFP表達(dá)量的比較
　　 采用Western Blot分析各組EGFP在大鼠腎臟、肺臟、心臟及肝臟的表達(dá)量，心肌多點(diǎn)注射組和停搏后冠脈灌注組心臟的EGFP表達(dá)量顯著高于腎、肺和肝的EGFP表達(dá)量（P＜0.01）;而傳統(tǒng)冠脈灌注組的肝臟的EGFP表達(dá)量則顯著高于心、腎和肺的EGFP表達(dá)量(P＜0.05)，但心臟的EGFP表達(dá)量

11、與腎和肺的EGFP表達(dá)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。
　　 （四）停搏后冠脈灌注組各不同時間點(diǎn)EGFP表達(dá)量的比較
　　 停搏后冠脈灌注組的EGFP表達(dá)量隨時間的延長而明顯減弱。與陰性對照組相比，轉(zhuǎn)染后4d組EGFP表達(dá)量顯著增高(2.484±0.315，P＜0.01);與轉(zhuǎn)染4d組相比，轉(zhuǎn)染7 d(0.234±0.040)、10 d(0.132±0.038)及14d組(0.045±0.008) EGFP表達(dá)量明顯

12、降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);而與陰性對照組相比，轉(zhuǎn)染后10、14d的EGFP表達(dá)量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。
　　 （五）不同轉(zhuǎn)染方法對大鼠心肌組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響比較
　　 陰性對照組心肌細(xì)胞形態(tài)良好，結(jié)構(gòu)完整，橫紋清晰;心肌多點(diǎn)注射組心肌組織呈現(xiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤，且有部分心肌壞死;傳統(tǒng)冠脈灌注組及停搏后冠脈灌注組心肌細(xì)胞形態(tài)良好，心肌組織結(jié)構(gòu)完整，無炎性細(xì)胞浸潤。
　　 第二部分:在大體

13、水平探討ANKB-W1535R對大鼠心電及相關(guān)蛋白表達(dá)量的影響
　　 （一）轉(zhuǎn)染ANKB-W1535R對大鼠心電圖的影響
　　 1、轉(zhuǎn)染ANKB-W1535R對大鼠心電圖形態(tài)的影響
　　 轉(zhuǎn)染4d后，各組大鼠檢測心電圖，心電圖形態(tài)均無顯著變化。ANKB-W1535R組的1只大鼠在運(yùn)動后心電圖出現(xiàn)了偶發(fā)的心臟逸搏。腹腔注射腎上腺素模擬大鼠應(yīng)激后，三組大鼠均無死亡。EGFP組在運(yùn)動后心率加快，心電圖形態(tài)無改變，而AN

14、KB-W1535R組中3只大鼠在運(yùn)動后心率加快(占42.9％)，4只心率變異性高（占57.1％）。運(yùn)動加應(yīng)激后ANKB-W1535R組4只大鼠在應(yīng)激5-15min后均出現(xiàn)了多形性室性心動過速，而陰性對照組及EGFP組大鼠在運(yùn)動加應(yīng)激后只出現(xiàn)心率增快，未出現(xiàn)心電圖形態(tài)的變化。
　　 轉(zhuǎn)染ANKB-W1535R對大鼠心電圖QT間期(QTc)的影響:不同處理組之間心電圖QTc差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=7.769，P=0.004)。ANKB

15、-W1535R組QTc最高(206.99±32.70) ms。采用LSD兩兩比較可見，ANKB-W1535R組與陰性對照組(155.17±13.96)和EGFP組(168.83±21.91)相比，QTc差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P值分別為0.002，0.014）;而陰性對照組與EGFP組相比，QTc差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.353)。
　　 轉(zhuǎn)染ANKB-W1535R對大鼠心電圖PR、QRS間期及P波的影響:不同處理組之間PR、QRS間

16、期及P波差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（F值分別為0.674，2.031，0.257;P值分別為0.524，0.164，0.777）。
　　 2、轉(zhuǎn)染ANKB-W1535R對大鼠心率的影響
　　 運(yùn)動加應(yīng)激后，不同處理組之間心率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.619，P=0.551)。ANKB-W1535R組大鼠在應(yīng)激后25 min內(nèi)心率顯示高度的變異性，心率最高時達(dá)586 BPM，最低時只有248.62 BPM。陰性對照組和EGFP組大

17、鼠心率隨時間的變化不大，陰性對照組心率在394 BPM至430 BPM之間變化，EGFP組心率在381 BPM至478 BPM之間變化。
　　 綜上所述，轉(zhuǎn)染ANKB-W1535R可以導(dǎo)致大鼠QTc延長、偶發(fā)心臟逸搏，應(yīng)激后心率變異性增高、出現(xiàn)多形性室性心動過速，而這些均符合人類LQT4的心電圖特點(diǎn)，因此，我們判斷轉(zhuǎn)染ANKB-W1535R建立LQT4模型成功。
　　 （二）Western blot測定ANKB、Na+/

18、K+ATPα1/α2、NCX1和IP3R蛋白表達(dá)水平
　　 1、轉(zhuǎn)染ANKB-W1535R對大鼠心肌組織ANKB表達(dá)量的影響:不同處理組之間ANKB表達(dá)量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=6.382，P=0.033)。ANKB-W1535R組大鼠的ANKB蛋白表達(dá)水平最低(0.489±0.091)，分別與陰性對照組(0.793±0.139)及EGFP組(0.764±0.110)相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P值分別為0.018、0.026);陰性對

19、照組與EGFP組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.766)。因此，轉(zhuǎn)染ANKB-W1535R能導(dǎo)致ANKB表達(dá)量減少。
　　 2、轉(zhuǎn)染ANKB-W1535R對大鼠心肌組織Na+/K+ATPaseα1表達(dá)量的影響:不同處理組之間Na+/K+ATPaseα1表達(dá)量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=13.875，P=0.006)。ANKB-W1535R組大鼠的Na+/K+ATPaseα1蛋白表達(dá)水平最低(0.620±0.119)，分別與陰性對照組(1

20、.291±0.193)及EGFP組(1.031±0.151)相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P值分別為0.002、0.019);陰性對照組與EGFP組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.090)。因此，轉(zhuǎn)染ANKB-W1535R能導(dǎo)致Na+/K+ATPα1表達(dá)量減少。
　　 3、轉(zhuǎn)染ANKB-W1535R對大鼠心肌組織Na+/K+ATPaseα2表達(dá)量的影響:不同處理組之間Na+/K+ATPaseα2表達(dá)量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=5.665，P=

21、0.042)。ANKB-W1535R組大鼠的Na+/K+ATPaseα2蛋白表達(dá)水平最低(0.101±0.021)，分別與陰性對照組(0.196±0.040)及EGFP組(0.201±0.055)相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P值分別為0.030、0.024）;陰性對照組與EGFP組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.883）。因此，轉(zhuǎn)染ANKB-W1535R能導(dǎo)致Na+/K+ATPα2表達(dá)量減少。
　　 4、ANKB-W1535R對大鼠心肌

22、組織NCX1表達(dá)量的影響:不同處理組之間NCX1表達(dá)量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=7.033，P=0.027)。ANKB-W1535R組大鼠的NCX1蛋白表達(dá)水平最低(0.370±0.151)，分別與陰性對照組(0.741±0.141)及EGFP組(0.694±0.098)相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P值分別為0.014、0.024);陰性對照組與EGFP組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.682）。因此，轉(zhuǎn)染ANKB-W1535R能導(dǎo)致NCX1表達(dá)量

23、減少。
　　 5、轉(zhuǎn)染ANKB-W1535R對大鼠心肌組織IP3R表達(dá)量的影響:不同處理組之間IP3R表達(dá)量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=6.511，P=0.031)。ANKB-W1535R組大鼠的IP3R蛋白表達(dá)水平最低(0.530±0.125)，分別與陰性對照組(1.037±0.188)及EGFP組(0.960±0.228)相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P值分別為0.015、0.030);陰性對照組與EGFP組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.

24、629)。因此，轉(zhuǎn)染ANKB-W1535R能導(dǎo)致IP3R表達(dá)量減少。
　　 第三部分:在細(xì)胞水平探討轉(zhuǎn)染ANKB-W1535R對大鼠心肌細(xì)胞Ca2+瞬變及相關(guān)蛋白表達(dá)和定位的影響
　　 （一）心肌細(xì)胞重組腺病毒載體的轉(zhuǎn)染效率
　　 急性分離的心肌細(xì)胞成活率可達(dá)80％以上。在心肌細(xì)胞用重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染48 h后，細(xì)胞存活率達(dá)70％以上，轉(zhuǎn)染效率約為100％。
　　 （二）心肌細(xì)胞ANKB、Na+/K+AT

25、Pα1/α2、NCX1及IP3R的免疫熒光染色
　　 1、ANKB免疫熒光染色結(jié)果:陰性對照組和EGFP組心肌細(xì)胞的ANKB沿細(xì)胞橫管（T管）區(qū)域呈條形分布，熒光清晰明亮。而ANKB-W1535R組ANKB分布紊亂，熒光強(qiáng)度最弱(29.441±4.474)，分別與陰性對照組(52.425±7.619)及EGFP組(48.762±6.573)相比有顯著差異（P值分別為0.004、0.010）;陰性對照組與EGFP組相比差異無統(tǒng)計學(xué)

26、意義(P=0.507)。
　　 2、Na+/K+ATPα1免疫熒光染色結(jié)果:陰性對照組和EGFP組心肌細(xì)胞的Na+/K+ATPα1在細(xì)胞膜及橫管（T管）區(qū)域均有染色，熒光清晰明亮。而ANKB-W1535R組Na+/K+ATPα1分布紊亂，熒光強(qiáng)度最弱(16.110±3.640)，分別與陰性對照組(42.083±11.637)及EGFP組(44.363±7.345)相比有顯著差異（P值分別為0.008、0.006）;陰性對照組與E

27、GFP組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.746)。
　　 3、Na+/K+ATPα2免疫熒光染色結(jié)果:陰性對照組和EGFP組心肌細(xì)胞的Na+/K+ATPα2沿細(xì)胞橫管（T管）區(qū)域呈條形分布，熒光清晰明亮。而ANKB-W1535R組Na+/K+ATPα2分布紊亂，熒光強(qiáng)度最弱(23.191±2.997)，分別與陰性對照組(42.029±7.672)及EGFP組(45.202±8.269)相比有顯著差異（P值分別為0.007、0.01

28、4）;陰性對照組與EGFP組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.585)。
　　 4、NCX1免疫熒光染色結(jié)果:陰性對照組和EGFP組心肌細(xì)胞的NCX1沿細(xì)胞橫管（T管）區(qū)域呈條形分布，熒光清晰明亮。而ANKB-W1535R組NCX1分布紊亂，熒光強(qiáng)度最弱(10.219±3.330)，分別與陰性對照組(42.582±7.197)及EGFP組(39.483±5.372)相比有顯著差異（P值分別為0.000、0.001）;陰性對照組與EG

29、FP組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.518）。
　　 5、IP3R免疫熒光染色結(jié)果:陰性對照組和EGFP組心肌細(xì)胞的IP3R沿細(xì)胞橫管（T管）區(qū)域呈條形分布，熒光清晰明亮。而ANKB-W1535R組IP3R分布紊亂，熒光強(qiáng)度最弱(12.386±3.862)，分別與陰性對照組(40.514±5.659)及EGFP組(40.509±9.610)相比有顯著差異（P值均為0.002）;陰性對照組與EGFP組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.

30、999)。
　　 綜上所述，轉(zhuǎn)染ANKB-W1535R能導(dǎo)致ANKB及其結(jié)合蛋白Na+/K+ATPα1/α2、NCX1及IP3R表達(dá)量減少，并減弱這些蛋白在橫管靶向定位功能。
　　 （三）心肌細(xì)胞Ca2+瞬變
　　 不同處理組心肌細(xì)胞的收縮性（場刺激引起細(xì)胞長度縮短的最大值與收縮前長度的比值）:陰性對照組為(9.21±1.23)％，EGFP組為(9.20±1.50)％，ANKB-W1535R組為(8.97±0.9

31、9)％，各組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=1.348，P=0.261)，說明心肌細(xì)胞的收縮性并未受影響;ANKB-W1535R組Ca2+瞬變峰值(△F/F0)最高(1.43±0.14)，與陰性對照組(1.03±0.19)和EGFP組(0.98±0.21)相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P值分別為0.036，0.023）;不同處理組的Ca2+瞬變上升時間(rise time)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=1.384，P=0.252);不同處理組的Ca2+瞬變

32、半數(shù)衰減時間(FDHM)差異顯著(F=79.19，P=0.000)，與陰性對照組(129.87±11.91 ms)及EGFP組為(126.59±13.77ms)相比，ANKB-W1535R組(153.64±23.40ms)的FDHM最高（P值均為0.000），說明Ca2+回收機(jī)制受損。
　　 結(jié)論
　　 1、改良過的停搏后冠脈灌注法應(yīng)用于轉(zhuǎn)染大鼠心肌細(xì)胞，具備較高轉(zhuǎn)染效率、轉(zhuǎn)染分布均勻、心外組織轉(zhuǎn)染量少、存活率較高及對心