靶向SMPD1基因的RNA干擾對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用研究.pdf

1、本研究針對(duì)人類SMPD1基因，設(shè)計(jì)合成了6對(duì)siRNA，分別以人成纖維細(xì)胞和顆粒細(xì)胞對(duì)其基因沉默效率進(jìn)行篩選，獲得2對(duì)理想的siRNA，進(jìn)一步檢測(cè)了它們?cè)诔衫w維細(xì)胞中發(fā)揮作用的量效和時(shí)效關(guān)系。以絲裂霉素誘導(dǎo)的人卵巢顆粒細(xì)胞凋亡模型作為研究對(duì)象，按照摸索的最佳量效和時(shí)效關(guān)系，利用優(yōu)選的siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞，觀察細(xì)胞活力和細(xì)胞凋亡的情況。結(jié)果顯示，siRNA對(duì)細(xì)胞毒性藥物引起的人卵巢顆粒細(xì)胞凋亡具有明顯的保護(hù)作用。本研究包括三個(gè)部分，詳述如下

2、： 第一部分細(xì)胞原代培養(yǎng)、鑒定及SMPD1的檢測(cè) [目的]:分離、純化、培養(yǎng)人包皮成纖維細(xì)胞和人卵巢顆粒細(xì)胞，為進(jìn)一步的siRNA篩選，沉默效率檢測(cè)及RNA干擾實(shí)驗(yàn)提供細(xì)胞模型奠定方法學(xué)基礎(chǔ)。 [方法]: 1.應(yīng)用胰酶及膠原酶聯(lián)合消化法進(jìn)行原代人包皮成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)，通過形態(tài)學(xué)觀察和波形蛋白(Vimentin)免疫熒光檢測(cè)對(duì)其進(jìn)行鑒定。 2.應(yīng)用密度梯度離心及胰酶消化法進(jìn)行原代人卵巢黃素化顆粒

3、細(xì)胞的分離培養(yǎng)，通過形態(tài)學(xué)觀察和卵泡刺激素受體(FSHR)免疫熒光法檢測(cè)對(duì)其進(jìn)行鑒定。 3.通過RT-PCR檢測(cè)SMPD1基因的mRNA，免疫熒光檢測(cè)SMPD1的蛋白以確定兩種細(xì)胞內(nèi)源性表達(dá)靶基因。 [結(jié)果]:成纖維細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，排列成束狀或漩渦狀。其波形蛋白陽性率達(dá)到96％。人卵巢顆粒細(xì)胞貼壁，呈星形生長(zhǎng)，胞漿富含顆粒。FSHR的陽性率為75％～85％。兩種細(xì)胞均有SMPD1基因mRNA及蛋白的表達(dá)。 [結(jié)論]

4、:本實(shí)驗(yàn)成功地進(jìn)行了原代人包皮成纖維細(xì)胞和人卵巢顆粒細(xì)胞的培養(yǎng)，細(xì)胞純度高，內(nèi)源性表達(dá)SMPD1基因，可作為細(xì)胞模型應(yīng)用于進(jìn)一步的siRNA篩選、鑒定及RNA干擾實(shí)驗(yàn)。 第二部分siRNA的設(shè)計(jì)和篩選 [目的]:以人包皮成纖維細(xì)胞為模型，通過設(shè)計(jì)合成，實(shí)驗(yàn)篩選，獲得高效、特異沉默SMPD1基因的siRNA，通過觀察siRNA對(duì)靶基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和翻譯產(chǎn)物沉默的量效和時(shí)效關(guān)系，系統(tǒng)了解sirNA在細(xì)胞內(nèi)的時(shí)空作用方式及代謝特征

5、，為進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方案，獲得最佳的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，為下一步細(xì)胞凋亡保護(hù)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。 [方法]: 1.針對(duì)SMPD1特異序列設(shè)計(jì)合成6對(duì)siRNA，另設(shè)隨機(jī)序列作為陰性對(duì)照(notargetsiRNA，NTsiRNA)。 2.用陽離子脂質(zhì)體(Lipofectamine2000)作為轉(zhuǎn)染試劑，熒光標(biāo)記的dsRNA低聚體(Fluorescentoligo)作為轉(zhuǎn)染效率的指示劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化和轉(zhuǎn)染效率的檢測(cè)。

6、不同濃度oligo(40nmol/L,60nmol/L,80nmol/L，100nmol/L)和lipofectamine2000(0.5μL，1μL，1.5μL)共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后6h熒光顯微鏡下觀察、計(jì)數(shù)，計(jì)算陽性細(xì)胞率。免疫熒光觀察轉(zhuǎn)染后細(xì)胞形態(tài)，流式細(xì)胞儀定量檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。 3.有效siRNA篩選：按照優(yōu)化的轉(zhuǎn)染條件，實(shí)驗(yàn)組為siRNA1至sirNA6共6組，設(shè)立NTsiRNA對(duì)照，脂質(zhì)體對(duì)照。siRNA濃度為50nmo

7、l/L，轉(zhuǎn)染48h后進(jìn)行熒光定量RT-PCR檢測(cè)SMPD1mRNA水平變化，轉(zhuǎn)染72h后行WesternBlot檢測(cè)SMPD1蛋白水平的變化。 4.siRNA量效關(guān)系：用篩選出靶基因沉默效率最高的siRNA，以不同濃度siRNA(0.5、5、50、100nmol/L)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，分別以NTsirNA、脂質(zhì)體及Fluorescentoligo為對(duì)照，轉(zhuǎn)染后6h觀察熒光oligo的強(qiáng)度以確定轉(zhuǎn)染效率不低于80％，轉(zhuǎn)染后24h進(jìn)行熒光定

8、量RT-PCR，以脂質(zhì)體組為對(duì)照計(jì)算抑制率，繪制量效曲線。 5.siRNA時(shí)效關(guān)系：使用最佳siRNA的最佳濃度轉(zhuǎn)染細(xì)胞，分別以NTsiRNA、脂質(zhì)體及Fluorescentoligo為對(duì)照，于轉(zhuǎn)染不同時(shí)間(12、24、48、72h)后收集細(xì)胞，進(jìn)行熒光定量RT-PCR的檢測(cè)。以脂質(zhì)體組為對(duì)照計(jì)算抑制率，繪制時(shí)效曲線。 6.siRNA對(duì)蛋白水平變化的時(shí)效關(guān)系：細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA，轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn)(24、48、72、96h

9、)進(jìn)行細(xì)胞總蛋白提取，BCA法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。用蛋白印跡法進(jìn)行SMPD1蛋白的檢測(cè)，β-actin作為內(nèi)參。 [結(jié)果]: 1.在人包皮成纖維細(xì)胞，lipofectamine20001.0μL可以達(dá)到最佳轉(zhuǎn)染效率，其值為98.3％。 2.在人包皮成纖維細(xì)胞中各條siRNA對(duì)SMPD1基因mRNA表達(dá)均有抑制作用，其中siRNA1的抑制率最佳，為96.29±4.58％。蛋白表達(dá)水平變化與mRNA一致。 3.s

10、iRNA濃度在0.5～50nmol/L之間目的基因的抑制率是逐漸上升的，當(dāng)siRNA濃度達(dá)到100nmol/L時(shí)，抑制率下降，而陰性對(duì)照NT、siRNA的抑制率則上升。用50nmol/L濃度的siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞，mRNA在48h后達(dá)到最大的抑制率，蛋白在轉(zhuǎn)染72h后達(dá)到最大的抑制率，96h恢復(fù)正常。β-actin各組無差異。 [結(jié)論]:在人包皮成纖維細(xì)胞達(dá)到最佳抑制效率的siRNA序列是siRNA1。靶向SMPD1的siRNA最

11、佳作用濃度為50nmol/L。SMPD1基因mRNA水平在48h達(dá)到最大抑制率，蛋白水平在72h達(dá)到最大抑制率，其后SMPD1表達(dá)逐漸恢復(fù)到轉(zhuǎn)染前水平。 第三部分靶向SMPD1的siRNA對(duì)顆粒細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用 [目的]:通過觀察靶向SMPD1的siRNA對(duì)化療藥物絲裂霉素誘導(dǎo)的顆粒細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用，從細(xì)胞水平上評(píng)估siRNA對(duì)女性生殖保護(hù)的潛能，為將來的動(dòng)物整體實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。 [方法]: 1.轉(zhuǎn)染條

12、件的優(yōu)化和轉(zhuǎn)染效率的檢測(cè)。不同濃度oligo(40nmol/L，60nmol/L，80nmol/L，100nmol/L)和lipofectamine2000(0.5μL，1μL，1.5μL)共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后6h熒光顯微鏡下觀察、計(jì)數(shù)，計(jì)算陽性細(xì)胞率。免疫熒光觀察轉(zhuǎn)染后細(xì)胞形態(tài)，流式細(xì)胞儀定量檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。 2.有效siRNA篩選：按照優(yōu)化的轉(zhuǎn)染條件，實(shí)驗(yàn)組為sirNA1至sirNA6共6組，設(shè)立NTsiRNA對(duì)照，脂質(zhì)體對(duì)照。

13、siRNA濃度為50nmol/L，轉(zhuǎn)染48h后進(jìn)行熒光定量RT-PCR檢測(cè)SMPD1mRNA水平變化，轉(zhuǎn)染72h后行WesternBlot檢測(cè)SMPD1蛋白水平的變化。 3.絲裂霉素(MMC)致凋亡有效濃度的篩選：用不同濃度絲裂霉素干預(yù)細(xì)胞，24h后MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力，篩選出有效的藥物濃度用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。 4.siRNA對(duì)絲裂霉素誘導(dǎo)的顆粒細(xì)胞凋亡的抑制作用：細(xì)胞接種24h后轉(zhuǎn)染siRNA，轉(zhuǎn)染48h后給予絲裂霉素，藥物

14、干預(yù)24h后收集細(xì)胞，分別進(jìn)行Hochest/PI雙染檢測(cè)細(xì)胞凋亡形態(tài)，MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力，AnnexinV-PI雙染行流式細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。以同樣濃度的NTsiRNA，脂質(zhì)體為對(duì)照。 [結(jié)果]: 1.在人卵巢顆粒細(xì)胞，lipofectamine20001.5μL可以達(dá)到最佳轉(zhuǎn)染效率，其值為61.6％。 2.在人卵巢顆粒細(xì)胞中只有siRNA3對(duì)SMPD1基因mRNA表達(dá)有抑制作用，抑制率為44.7±4.69％

15、。蛋白表達(dá)水平變化與mRNA一致。 3.MMC濃度在15μg/mL時(shí)人卵巢顆粒細(xì)胞凋亡率明顯增高，達(dá)到33.28％。 4.在阻斷了SMPD1基因的表達(dá)后，siRNA3組活細(xì)胞染色明顯增高，細(xì)胞存活率達(dá)到40.3％，與MMC組32.3％比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。siRNA3組細(xì)胞凋亡率為44％，明顯低于MMC組的68.3％。 [結(jié)論]: 靶向SMPD1的siRNA能夠有效抑制絲裂霉素誘導(dǎo)的人卵巢顆粒細(xì)胞凋亡。