雞卵巢顆粒細(xì)胞中AMH基因功能的研究.pdf

1、抗繆勒氏管激素(anti-Müllerian hormone，AMH)作為雌性動(dòng)物體內(nèi)目前已知的唯一抑制始基卵泡生長(zhǎng)的細(xì)胞因子，能夠抑制芳香化酶活性、減少原始卵泡初始募集、降低卵泡FSH敏感性進(jìn)而抑制卵巢功能。但禽類(lèi)AMH的研究較少。本研究主要通過(guò)對(duì)雞原代卵巢顆粒細(xì)胞中AMH基因進(jìn)行靶向敲除和過(guò)表達(dá)，改變顆粒細(xì)胞中AMH及相關(guān)基因的表達(dá)水平，進(jìn)而分析雞卵巢顆粒細(xì)胞AMH在卵泡發(fā)育中的功能。結(jié)果如下:
　　1.構(gòu)建靶向雞AMH基因敲

2、除表達(dá)載體pll3.7-U6-SgAMH-spCas9和與之對(duì)應(yīng)的SSA-RPG雙熒光篩選報(bào)告載體pB-CMV-DsRed-CA G-AMH.200bp repeat.Puro-T2A-GFP，共轉(zhuǎn)染雞DF-1細(xì)胞系，報(bào)告載體水平敲除陽(yáng)性細(xì)胞約占轉(zhuǎn)染細(xì)胞的5％。T7E1酶切結(jié)果表明經(jīng)Puromycin篩選可以明顯富集陽(yáng)性細(xì)胞，TA克隆測(cè)序表明篩選富集后DF-1中靶位點(diǎn)突變效率高達(dá)50％。
　　2.雞卵巢顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng)容易自發(fā)凋亡

3、，喪失特征性表型，同時(shí)失去FSH處理效應(yīng)。通過(guò)改進(jìn)分離方法、選擇基礎(chǔ)培養(yǎng)基、優(yōu)化血清濃度，添加適宜濃度的激素、生長(zhǎng)因子、維生素以及預(yù)鋪鼠尾膠原，對(duì)培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。最終建立了在預(yù)鋪鼠尾膠原作為胞外基質(zhì)，采用含10％FBS、1×非必需氨基酸、1×復(fù)合維生素溶液和1×Anti-anti的DMEM培養(yǎng)液的優(yōu)化培養(yǎng)體系，培養(yǎng)雞小黃卵泡GCs4代后仍能夠保持其細(xì)胞特性。
　　3.為了研究AMH基因在雞卵巢顆粒細(xì)胞中的功能，將構(gòu)建的敲除表達(dá)載

4、體和SSA-RPG篩選報(bào)告載體通過(guò)Lipofectamine@3000共轉(zhuǎn)至雞SYF卵巢顆粒細(xì)胞中，48h后報(bào)告載體水平轉(zhuǎn)染效率約有30％，敲除效率約占轉(zhuǎn)染細(xì)胞的5％;經(jīng)0.5μg/ml的Puromycin篩選進(jìn)行富集后提取細(xì)胞基因組，TA克隆測(cè)序結(jié)果顯示突變效率約為2％。構(gòu)建過(guò)表達(dá)載體pcDNA3.1-AMH與敲除載體分別轉(zhuǎn)染雞GCs，轉(zhuǎn)染24h后添加2.5units/ml FSH處理細(xì)胞48h，分析相關(guān)基因表達(dá)變化后發(fā)現(xiàn):在雞卵巢顆