槐耳通過(guò)上調(diào)肺癌細(xì)胞miR-26b-5p的表達(dá)抑制細(xì)胞增殖,促進(jìn)細(xì)胞凋亡.pdf

1、目的:從microRNA水平探討槐耳清膏抑制肺腺癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的抗腫瘤分子機(jī)制。
　　方法:1.利用CFSE染色法和Annexin V-FITC/PI雙染驗(yàn)證槐耳的抗腫瘤作用;2.利用基因芯片分析槐耳清膏處理前后肺癌細(xì)胞A549 miRNA表達(dá)譜的變化;3.利用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)部分miRNA的變化，來(lái)驗(yàn)證芯片結(jié)果的準(zhǔn)確性，并檢測(cè)幾種肺癌細(xì)胞系中miRNA的表達(dá)情況;4.目標(biāo)miRNA的mimic或inhibitor

2、轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞或槐耳作用后的A549細(xì)胞，檢測(cè)A549細(xì)胞增殖、凋亡情況;5.利用生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測(cè)miR-26b-5p的靶基因，并用報(bào)告基因技術(shù)驗(yàn)證miRNA的靶基因;6.利用基因干擾技術(shù)敲低miRNA的靶基因，并檢測(cè)靶基因敲低后，A549細(xì)胞增殖、凋亡情況;7.利用western blot檢測(cè)槐耳作用、miRNAmimic或inhibitor轉(zhuǎn)染后，A549細(xì)胞中miRNA靶基因及下游基因的蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果:1.槐耳

3、能抑制A549細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，并且這種作用具有時(shí)間和藥物濃度依賴(lài)性;2.槐耳清膏作用改變了A549細(xì)胞的miRNA表達(dá)譜，66種miRNA表達(dá)發(fā)生變化(fold change＞2)，其中上調(diào)和下調(diào)的miRNA各有33種;3.槐耳能上調(diào)A549細(xì)胞中miR-26b-5p的表達(dá)，qRT-PCR的結(jié)果與芯片結(jié)果一致，并且在幾種非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中，miR-26b-5p均呈低表達(dá);4.轉(zhuǎn)染了miR-26b-5p mimic的A549細(xì)胞

4、有明顯的抑制增殖，促進(jìn)凋亡作用，而miR-26b-5p inhibitor的轉(zhuǎn)染能削弱槐耳對(duì)細(xì)胞增殖的抑制和凋亡的促進(jìn)作用;5.生物信息學(xué)預(yù)測(cè)EZH2作為miR-26b-5p的靶基因之一，同時(shí)在幾種非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中EZH2均呈高表達(dá)，報(bào)告基因技術(shù)證實(shí)EZH2是miR-26b-5p的靶基因;6.在A549細(xì)胞中，EZH2的下調(diào)能抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡;7.在槐耳處理或miR-26b-5p mimic轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞中，EZH2、