Angiogenin及其與FHL3的相互作用調控人星形膠質瘤病情進展的分子機制研究.pdf

1、血管生成素(Angiogenin,Ang)是第一個來源于腫瘤同時具有血管生成能力的蛋白,Ang在很多疾病中的表達水平上調,但不是腫瘤特異性產(chǎn)物,其功能也不僅僅局限于促進血管生成,越來越多的研究表明其在促進腫瘤細胞增殖、存活及抑制腫瘤細胞凋亡方面也起到了重要的作用。Ang可能通過內皮細胞上的假定受體參與信號通路的活化從而促進細胞的增殖,也能在多能性p19鼠胚性癌細胞(pluripotent P19 mouse embryonal carc

2、inoma cells)中通過Bcl-2和NF-κB通路起到抗凋亡作用,并能夠定位于細胞核中參與對細胞的調控。
　　神經(jīng)膠質瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)腫瘤中最常見的類型,而人星形膠質瘤在各類神經(jīng)膠質腫瘤中最多見(75％),多形性膠質母細胞瘤(Glioblastoma multiforme,GBM)是惡性度最高的腦膠質瘤。目前即使有多種治療方法但預后仍是很差,嚴重影響患者的生活質量。在不同的顱內腦瘤中都能檢測到Ang的表達,而在低級別星形

3、膠質瘤中表達最低,并且Ang對于膠質瘤的惡性轉換起到重要作用。我們利用實時定量PCR檢測了Ang在星形膠質瘤各級別組織中的表達,發(fā)現(xiàn)其與疾病的惡性程度呈正相關。U87MG細胞屬于膠質母細胞瘤細胞株,MTT實驗表明Ang能夠促進U87MG細胞的增殖,并且上調抗凋亡蛋白Bcl-xL及促癌基因c-myc的表達。
　　在膠質瘤的發(fā)生發(fā)展和惡性演變過程中,胞內多種信號分子的表達均可能通過影響相關信號通路的變化,加速或延緩病情進展。NF-κB

4、在GBM中是活化的狀態(tài),并在GBM中參與細胞的存活、增殖及遷移。在不同級別的星形膠質瘤組織中,隨著級別的升高,ERK1/2及p38的磷酸化也升高,表明這兩條通路在星形膠質瘤中也是活化的。為進一步探討U87MG細胞中Ang促進細胞增殖是否與GBM中活躍的信號通路相關,我們用不同濃度的Ang體外刺激U87MG細胞,結果表明其促進了p38和NF-κB通路的活化,但是沒有影響ERK1/2的磷酸化,而分別阻斷p38及NF-κB通路,結果表明Ang

5、能夠通過活化NF-κB通路促進細胞的增殖。同時,Ang能夠進入U87MG細胞的細胞核內,阻斷Ang的入核部分抑制了Ang促進的細胞增殖。以上結果提示,Ang參與信號通路的調控并通過其核內的作用促進U87MG細胞的增殖。
　　那么,Ang在星形膠質瘤細胞中的作用機制在其他腫瘤細胞中是否存在,我們選擇HeLa細胞系進行比較。我們已知Ang能夠促進HeLa細胞的增殖并且進入細胞核內,與其在U87MG細胞中所產(chǎn)生的生物學效應一致。但Ang

6、是否參與HeLa細胞中信號通路的調節(jié)尚不清楚。結果顯示,Ang可以通過活化ERK通路促進HeLa細胞的增殖。同時,Ang在血液方面惡性腫瘤中的作用還不明確,其中惡性淋巴瘤是目前發(fā)病率增長最快的惡性腫瘤之一,而B非霍金式淋巴瘤(B-NHL)約占惡性淋巴瘤的60%。結果顯示,Ang在B非霍金式淋巴瘤(B-NHL)患者的外周血中的表達與正常人沒有明顯差異。高濃度的Ang反而抑制了淋巴瘤細胞Ramos的增殖及NF-κB、ERK通路的活化。以上結

7、果提示,Ang在不同細胞內及腫瘤內對于信號通路的調控并不一致,這一現(xiàn)象為更好的闡述Ang對星形膠質瘤的調控提供了有效的比較及分析。
　　為了更好的闡明Ang的表達水平與星形膠質瘤病情進展的關聯(lián)及調控的分子機制,我們對前期篩選出來的Ang相互作用蛋白FHL3進行了GSTpull-down及CoIP實驗的驗證。FHL3(four and a half LIM domains protein 3)屬于LIM蛋白質超家族成員,可以通過LI

8、M結構域與蛋白發(fā)生相互作用,并且FHL3能夠通過Smads介導的信號通路抑制腫瘤細胞的生長。此外,FHL3能夠與ERK2相互作用,參與對ERK通路的調控。我們檢測發(fā)現(xiàn)FHL3的表達水平與星形膠質瘤的病情進展呈負相關,且高濃度的FHL3能夠抑制U87MG細胞的增殖,但是在FHL3敲低的情況下,沒有影響p38及IκBα的磷酸化,反而促進了Ang誘導的信號分子的活化、Ang的入核及Ang促進U87MG細胞的增殖。這表明FHL3能夠通過調控An

9、g活化的信號通路及Ang的入核從而參與Ang促進的U87MG細胞的增殖。而在HeLa細胞中,敲低FHL3的表達卻能夠抑制Ang促進的ERK1/2的磷酸化,同時抑制Ang的入核及Ang促進的Ang結合元件(ABE,ctctctctctctctctccctc)的轉錄激活活性,最終抑制了Ang促進的HeLa細胞的增殖。這表明FHL3也能夠通過參與Ang調節(jié)的信號通路及其核作用參與Ang促進的HeLa細胞的增殖,但是卻起到了與在U87MG細胞中

10、相反的作用。以上結果提示在不同的腫瘤細胞中,FHL3參與介導Ang功能的機制不同。
　　由于FHL3參與Smad通路的調控,但是在U87MG細胞中很難檢測到本底水平的Smad2的磷酸化,我們利用Smad通路激活因子TGFβ1來更好的研究Ang的調控機制。結果意外的發(fā)現(xiàn),在U87MG細胞中,TGFβ1抑制Ang的表達和ERK1/2的磷酸化及Ang誘導的p38的活化,這一結果提示,雖然Ang沒有直接參與Smad2的磷酸化,但是其與TG

11、Fβ1之間的關系能夠為進一步研究Ang可能的調控機制奠定基礎。而在HeLa細胞中,Ang可以有效的抑制Smad2的磷酸化,但是TGFβ1沒有抑制Ang的過表達,反而是Ang抑制了TGFβ1促進的Smad2的磷酸化,這為Ang促進HeLa細胞增殖又提供了一條線索。
　　由于Ang具有核糖核酸酶及轉錄因子活性,我們選擇microRNAs(miRNAs)及其與Ang的反饋調節(jié)進一步探討Ang調控星形膠質瘤可能的分子機制。MiRNAs是一

12、類內源性的長度約為22個核苷酸的非編碼小分子RNA。它主要通過與靶標基因3′UTR的完全或不完全配對,降解靶標基因mRNA或抑制其翻譯,從而參與細胞增殖、凋亡、分化、代謝和腫瘤轉移。MiRNAs在調節(jié)內皮細胞功能特別是血管生成方面有重要作用。我們通過生物信息學篩選出對Ang有調控作用的miRNAs,qPCR檢測Ang在U87MG細胞的表達,同時選擇HeLa細胞、HepG2細胞及HUVEc細胞進行比較分析,結果顯示只有在HUVEc中miR

13、409-3p能夠在mRNA及蛋白水平抑制Ang的表達。
　　另一方面,由于Ang具有胰核糖核酸酶活性,能夠催化rRNA的28S和18S的剪切。同時Ang可能作為轉錄因子進行調控,其入核后與DNA結合并促進rRNA轉錄,并且從rRNA基因非轉錄區(qū)克隆得到一段與Ang結合的序列ABE。雙熒光素酶報告基因分析顯示HeLa細胞中Ang可促進ABE序列的啟動子活性,且ABE表現(xiàn)出依賴Ang的啟動子活性,這表明Ang可能具有轉錄因子活性。我們

14、經(jīng)BLAST分析,選取部分有研究意義的基因,分別調取了其5’上游2000bp以內含有7個以上CT重復序列的部分片段,經(jīng)雙熒光素酶報告基因檢測了Ang對這些啟動子序列的影響,發(fā)現(xiàn)黑皮質素3受體(melanocortin 3 receptor,MC3R)的部分啟動子序列的轉錄激活活性受到Ang的上調,這表明Ang可能會調控MC3R的表達。我們利用Ang刺激細胞,提取miRNAs,qPCR檢測預計的可能受Ang調控的miRNAs的表達水平,結

15、果發(fā)現(xiàn)只有miR17-3p在U87MG細胞、HeLa細胞、HUVEc中的表達水平一致,都受到了Ang明顯的抑制,并且miR17-3p在星形膠質瘤組織中的表達水平低于正常組織。以上結果提示Ang在U87MG細胞中下調miR17-3p的表達將為深入了解Ang調控星形膠瘤的發(fā)生發(fā)展提供線索。
　　綜上所述,Ang及其與FHL3的相互作用和miRNAs與Ang反饋調節(jié)的研究不僅為探討Ang調控星形膠質瘤抗凋亡的分子調控機制提供新理論和線索