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文檔簡介
1、目的:
通過體內(nèi)外實驗證明miR-127參與肺癌的發(fā)生與發(fā)展;探明miR-127在肺癌中的重要調(diào)控功能;深入研究miR-127對于肺癌進展的分子調(diào)控機制。
方法:
1.分別用原位雜交和Real time PCR方法檢測人肺癌組織標本和不同人肺癌細胞系中miR-127的表達;分別建立miR-127過表達的PC9細胞和miR-127敲減的A549穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系,并用Real time PCR方法檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞
2、系中miR-127的變化水平。
2.Real time PCR和Western blot方法檢測PC9細胞過表達miR-127和A549細胞敲減miR-127后EM T相關(guān)的分子標志物的表達差異。
3.體外轉(zhuǎn)移和侵襲實驗檢測PC9細胞過表達miR-127和A549細胞敲減miR-127后,腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力的變化。
4.腫瘤干性實驗和軟瓊脂實驗檢測 PC9細胞過表達 miR-127和A549細胞敲減m
3、iR-127后,腫瘤細胞的腫瘤干性與克隆形成率。MTS和Western blot方法檢測PC9細胞過表達miR-127和A549細胞敲減miR-127后,對于Gefitinib誘導細胞凋亡的敏感性的變化,及對于Gefitinib所引起AKT和ERK的磷酸化水平的改變。裸鼠成瘤實驗檢測miR-127過表達的PC9細胞和miR-127敲減的A549細胞系與對照組相比的成瘤能力,用免疫組織化方法檢測Vimentin、Ki67、MMP9和TNF
4、AIP3在裸鼠腫瘤組織中的表達。
5.Real time PCR和Western blot方法檢測PC9細胞過表達miR-127和A549細胞敲減 miR-127前后,TNFAIP3的表達的變化;雙熒光素酶報告基因檢測 miR-127對TNFAIP3的直接靶向抑制作用。
6.Western blot的方法檢測PC9及A549細胞過表達及抑制miR-127前后,經(jīng)TNF-α作用后NF-κB信號通路相關(guān)蛋白IKKα/β、
5、IκBα及p65的磷酸化水平的變化及RIP1的K63泛素化水平的變化。
7.體外轉(zhuǎn)移實驗、侵襲實驗、MTS實驗及 Western blot的方法檢測 TNFAIP3對miR-127調(diào)控肺癌過程的作用。
結(jié)果:
1.人肺癌組織與人肺癌細胞系中,miR-127異常高表達。
2.PC9細胞過表達miR-127后,上皮細胞標志分子E-Cadherin顯著下調(diào),間質(zhì)細胞標志分子N-Cadherin、ZEB1
6、和Vimentin顯著上調(diào)。A549細胞敲減 miR-127后,上皮細胞標志分子E-Cadherin顯著上調(diào),間質(zhì)細胞標志分子N-Cadherin、ZEB1和Vime nt in顯著下調(diào)。
3.PC9細胞過表達miR-127后,細胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力顯著增加;而A549細胞敲減miR-127后,細胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力顯著減弱。
4.miR-127促進 PC9細胞的腫瘤干性,同時促進了體內(nèi)腫瘤細胞的生長;而敲減miR-12
7、7的A549細胞腫瘤干性減弱,體內(nèi)的腫瘤細胞生長減緩。Gefitinib降低PC9和A549細胞的磷酸化水平,從而抑制腫瘤細胞的生長。miR-127過表達的PC9細胞與對照組相比,對于Gefitinib誘導細胞凋亡的敏感性降低,同時上調(diào)了AKT與ERK的磷酸化水平;而敲減 miR-127后,A549細胞凋亡增加,AKT與ERK的磷酸化水平顯著下調(diào)。miR-127上調(diào) Vimentin、Ki67、MMP9等蛋白的表達,抑制TNFAIP3蛋
8、白的表達。
5.在穩(wěn)定過表達miR-127的PC9細胞系中,與對照組相比,TNFAIP3的表達明顯下調(diào),在穩(wěn)定敲減miR-127的A549細胞系中,與對照組相比,TNFAIP3的表達明顯上調(diào),雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烇@示miR-127可直接靶向抑制TNFAIP3的3’-UTR序列。
6.PC9細胞過表達miR-127后,與對照組相比經(jīng) TNF-α作用后NF-κB信號通路中IKKα/β、IκBα及 p65的磷酸化水平明顯
9、上調(diào),RIP1的K63泛素化水平增強;而A549細胞抑制 miR-127表達后,與對照組相比經(jīng)TNF-α作用后IKKα/β、IκBα及p65的磷酸化水平明顯下降,RIP1的K63泛素化水平減弱。在 miR-127過表達的PC9細胞中轉(zhuǎn)染TNFAIP3真核表達載體后,miR-127所引起的NF-κB信號通路的變化有所回復。
7.在 miR-127過表達的PC9細胞中轉(zhuǎn)染 TNFAIP3真核表達載體,可抑制細胞的EMT、轉(zhuǎn)移和侵襲
10、能力;miR-127過表達的PC9細胞中轉(zhuǎn)染TNFAIP3真核表達載體,在 Gefitinib誘導下,miR-127對腫瘤細胞的抑制凋亡作用得到抑制,AKT與ERK的磷酸化水平有所回復。
結(jié)論:
1.肺癌組織中miR-127呈現(xiàn)顯著高表達。
2.miR-127促進肺癌細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移、生長及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EM T)。
3.miR-127可降低肺癌細胞對于Gefitinib誘導的細胞凋亡的敏感性。
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