MiR-214在胃癌進(jìn)展中的功能作用及分子機(jī)制研究.pdf

1、第一部分，miR-214在胃癌細(xì)胞和胃癌組織中的表達(dá)及與臨床病理特征的關(guān)系
　　 [目的]檢測(cè)胃癌組織及胃癌細(xì)胞株中miR-214的表達(dá)水平以及與胃癌臨床病理特征的關(guān)系，初步探索miR-214在胃癌進(jìn)展中的功能作用。
　　 [方法]通過(guò)實(shí)時(shí)定量RT-PCR法檢測(cè)胃癌組織與癌旁組織以及人SGC-7901、BGC-823胃癌細(xì)胞株與人正常胃粘膜細(xì)胞GES-1中miR-214表達(dá)水平的差異，并利用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、Kaplan-

2、Meier生存分析法及Log-rank檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析胃癌組織中miR-214的表達(dá)水平與胃癌患者的年齡、性別、胃癌組織分型、臨床分期、腫瘤浸潤(rùn)層次、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移以及臨床預(yù)后等臨床特征之間的關(guān)系。
　　 [結(jié)果]胃癌SGC-7901、BGC-823細(xì)胞株中miR-214表達(dá)水平相對(duì)于GES-1正常胃粘膜細(xì)胞的2-△△Ct值分別為(4.20±0.25)(P<0.01)和(3.3±0.24)(P<0.05)，兩者之間具有顯著性差

3、異；胃癌組織中miR-214的表達(dá)水平相對(duì)于周圍正常胃粘膜組織的2-△△Ct值為(4.22±1.45)，兩者之間具有顯著性差異(P<0.01)；胃癌組織中miR-214的表達(dá)水平與腫瘤浸潤(rùn)深度有關(guān)，浸潤(rùn)深度越深，miR-214表達(dá)水平越高，具有顯著性差異(P=0.001)；與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)，有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的標(biāo)本miR-214表達(dá)水平更高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.005)；與胃癌的臨床分期密切相關(guān)，臨床分期越晚，miR-214的表達(dá)水平越高，并

4、具有顯著性差異(P=0.001)；miR-214低表達(dá)組患者中位生存時(shí)間為2.7年，高表達(dá)組中位生存時(shí)間為1.4年，兩組之間具有顯著性差異(P=0.012)，風(fēng)險(xiǎn)比(HR)為1.929(95％CI：1.497-2.360)。
　　 [結(jié)論]miR-214在胃癌組織和細(xì)胞中高表達(dá)，胃癌組織中miR-214的表達(dá)水平與胃癌的浸潤(rùn)深度、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，而與患者的臨床預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。
　　 第二部分，miR-214對(duì)胃癌BGC-

5、823細(xì)胞生物學(xué)行為及對(duì)順鉑耐藥性的影響
　　 [目的]觀察miR-214的異常表達(dá)對(duì)胃癌BGC-823細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲以及對(duì)順鉑耐藥性的影響。
　　 [方法]利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將miR-214mimics和inhibitor轉(zhuǎn)入胃癌BGC-823細(xì)胞以上調(diào)和下調(diào)細(xì)胞中miR-214的表達(dá)水平，采用MTT法和平板細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察胃癌細(xì)胞增殖變化，流式細(xì)胞儀檢測(cè)胃癌細(xì)胞的細(xì)胞周期和凋亡變化，Transwell

6、小室實(shí)驗(yàn)觀察胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲變化；并利用MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染miR-214前后胃癌細(xì)胞對(duì)順鉑的半數(shù)抑制濃度，以觀察胃癌細(xì)胞對(duì)順鉑耐藥性的變化。
　　 [結(jié)果]轉(zhuǎn)染miR-214mimics組BGC-823細(xì)胞的OD值較mimicscontrol組明顯升高，各時(shí)間點(diǎn)兩組之間均具有顯著性差異(P<0.05)，而轉(zhuǎn)染miR-214inhibitor組BGC-823細(xì)胞的OD值較inhibitorcontrol組明顯降低，各時(shí)間點(diǎn)兩組之

7、間均具有顯著性差異(P<0.05)；轉(zhuǎn)染miR-214mimics組PI值明顯高于mimicscontrol組，兩者之間有顯著性差異(P=0.04)，而轉(zhuǎn)染miR-214inhibitor組PI值明顯低于inhibitorcontrol組，兩者之間有顯著性差異(P=0.02)；轉(zhuǎn)染miR-214mimics組的CFE值明顯高于mimicscontrol組，兩者之間有顯著性差異(P=0.016)，轉(zhuǎn)染miR-214inhibitor組CF

8、E值明顯低于inhibitorcontrol組，兩者之間有顯著性差異(P=0.042)；轉(zhuǎn)染miR-214mimics組穿入濾膜細(xì)胞數(shù)明顯多于mimicscontrol組，兩者之間有顯著性差異(P=0.031)，轉(zhuǎn)染miR-214inhibitor組穿入細(xì)胞數(shù)明顯少于mimicscontrol組，兩者之間有顯著性差異(P=0.041)；轉(zhuǎn)染miR-214mimics組穿入Matrigel基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)明顯多于mimicscontrol組

9、，兩者之間有顯著性差異(P=0.037)，轉(zhuǎn)染miR-214inhibitor組穿入細(xì)胞數(shù)明顯少于mimicscontrol組，兩者之間有顯著性差異(P=0.032)；轉(zhuǎn)染miR-214mimics組胃癌細(xì)胞與陰性對(duì)照組以及miR-214inhibitor組胃癌細(xì)胞與陰性對(duì)照組的細(xì)胞凋亡無(wú)顯著性差異(P>0.05)；轉(zhuǎn)染miR-214mimics組和陰性對(duì)照組胃癌細(xì)胞對(duì)順鉑的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為16.26mg/L和8.63mg

10、/L，95％CI分別為(11.82，20.14)mg/L和(5.63，11.49)mg/L，兩者之間有顯著性差異(P<0.05)，而轉(zhuǎn)染miR-214inhibitor組和陰性對(duì)照組胃癌細(xì)胞IC50分別為10.24mg/L和4.83mg/L，95％CI分別為(6.64，13.64)mg/L和(3.28，6.49)mg/L，兩者之間具有顯著性差異(P<0.05)。
　　 [結(jié)論]胃癌細(xì)胞內(nèi)miR-214表達(dá)水平的上調(diào)可促進(jìn)細(xì)胞的增

11、殖、遷移和侵襲能力，并可提高胃癌細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性，而下調(diào)胃癌細(xì)胞中miR-214的表達(dá)水平可抑制細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，并可降低胃癌細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性，但對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡無(wú)明顯影響。
　　 第三部分，miR-214靶向調(diào)控PTEN基因表達(dá)及其功能作用
　　 [目的]預(yù)測(cè)并驗(yàn)證PTEN是miR-214的靶基因，闡述miR-214通過(guò)靶向調(diào)控PTEN基因的表達(dá)來(lái)影響B(tài)GC-823胃癌細(xì)胞的生物學(xué)功能。
　　 [方

12、法]根據(jù)miRNA靶基因數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)預(yù)測(cè)和篩選miR-214的靶基因，通過(guò)實(shí)時(shí)定量RT-PCR和Western-blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后胃癌細(xì)胞內(nèi)PTENmRNA和蛋白表達(dá)水平的變化，通過(guò)將pcDNA-PTEN質(zhì)粒和miR-214mimics共轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞以觀察細(xì)胞增殖、遷移、轉(zhuǎn)移和對(duì)順鉑耐藥性的變化，并通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。
　　 [結(jié)果]通過(guò)生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)PTEN基因是miR-214的潛在靶基因。實(shí)時(shí)定量RT-P

13、CR檢測(cè)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染miR-214mimics與mimicscontrol組胃癌BGC-823細(xì)胞中PTENmRNA表達(dá)水平無(wú)明顯變化，而轉(zhuǎn)染miR-214inhibitor與inhibitorcontrol組胃癌BGC-823細(xì)胞中PTENmRNA表達(dá)水平也無(wú)明顯變化，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。WesternBlot法檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-214mimics組胃癌細(xì)胞內(nèi)PTEN蛋白表達(dá)水平較mimicscontrol組顯

14、著降低，兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；而轉(zhuǎn)染miR-214inhibitor組胃癌細(xì)胞內(nèi)PTEN蛋白表達(dá)水平較inhibitorcontrol組顯著增高，兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染PTEN3'-UTR+miR-214mimics重組質(zhì)粒組熒光素蛋白的表達(dá)水平明顯降低，而PTEN3’-UTR+miR-214inhibitor重組質(zhì)粒組熒光素蛋白的表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。細(xì)

15、胞周期及克隆形成率檢測(cè)結(jié)果顯示miR-214mimics+pcDNA-PTEN組胃癌細(xì)胞PI值(40.97±4.12)％顯著低于miR-214mimics+pcDNA組(53.89±4.87)％，兩組之間具有顯著性差異(P=0.025)；miR-214mimics+pcDNA-PTEN組胃癌細(xì)胞CFE值(62.33±5.13)％顯著低于miR-214mimics+pcDNA組(47.67±6.43)％，兩組之間具有顯著性差異(P=0.0

16、37)。遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示miR-214mimics+pcDNA-PTEN組穿入濾膜的BGC-823細(xì)胞數(shù)明顯少于miR-214mimics+pcDNA組，分別為(81.00±9.54)/高倍視野和(107.33±11.37)/高倍視野，兩者之間有顯著性差異(P=0.037)；侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示miR-214mimics+pcDNA-PTEN組穿入Matrigel基質(zhì)膠的BGC-823細(xì)胞數(shù)明顯少于miR-214mimics+pcDNA組，

17、分別為(39.00±6.56)/高倍視野和(24.33±5.69)/高倍視野，兩者之間有顯著性差異(P=0.043)。胃癌細(xì)胞順鉑耐藥性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示miR-214mimics+pcDNA-PTEN組與miR-214mimics+pcDNA組順鉑對(duì)胃癌細(xì)胞的抑制率分別為(22.01±4.55)％和(24.04±5.21)％，兩組之間具無(wú)顯著性差異(P=0.64)。
　　 [結(jié)論]miR-214是通過(guò)在翻譯水平上靶向調(diào)節(jié)PTEN蛋白