DEC2在胃癌中的作用及分子機制研究.pdf

1、研究背景胃癌是我國常見的消化道惡性腫瘤，侵襲轉移是惡性腫瘤生物學行為的具體反映，研究胃癌侵襲轉移的精細調控機制，尋找、發(fā)現(xiàn)、和鑒定這個過程中的關鍵調控分子，對臨床腫瘤的預防與治療具有迫切的現(xiàn)實意義。多種轉錄因子和信號轉導蛋白的激活以及腫瘤相關基因的差異表達，均可影響腫瘤的惡性進程，其中，轉錄因子對下游基因的表達調控作用是腫瘤發(fā)生發(fā)展的關鍵。探索轉錄因子在腫瘤中的具體表達調控模式，可為腫瘤生物治療提供新的干預靶點和預測指標。
　　轉

2、錄因子DEC2是一個生長發(fā)育基因，具有堿性螺旋-環(huán)-螺旋(bHLH)結構，之前DEC2的功能研究多集中在DEC2對生物節(jié)律、生長發(fā)育及免疫應答的調節(jié)中，最近報道了DEC2以組織細胞特異性的方式參與調控腫瘤細胞惡性進程，研究發(fā)現(xiàn)，DEC2在胰腺癌腫瘤組織中表達低于癌旁正常組織，而在子宮內膜癌組織中表達高于癌旁正常組織。DEC2發(fā)揮作用主要體現(xiàn)在增殖凋亡調控和腫瘤細胞上皮間質轉化調控。一方面，DEC2對腫瘤細胞增殖凋亡具有雙重調節(jié)作用:DE

3、C2通過下調cyclin D1表達抑制乳腺癌細胞增殖;另一篇關于乳腺癌的研究報道稱，利用siRNA沉默乳腺癌細胞MCF-7中DEC2基因表達后，凋亡細胞數(shù)明顯增加，進一步實驗發(fā)現(xiàn)DEC2可調控Caspase8、Fas等基因的表達，通過死亡受體途徑發(fā)揮抗凋亡效應;另外，在口腔癌細胞HSC-3中，DEC2通過抑制促凋亡因子Bim的表達發(fā)揮抗凋亡效應。另一方面，DEC2對腫瘤細胞侵襲轉移具有雙重調節(jié)作用:在乳腺癌中，DEC2結合到缺氧誘導因子

4、(HIFs)啟動子上抑制其表達，從而抑制腫瘤細胞轉移;另外，通過與SP1競爭性結合TWIST1啟動子區(qū)的SP1結合位點，DEC2可抑制子宮內膜癌發(fā)生EMT相關的腫瘤轉移;在胰腺癌細胞BxPC-3中，DEC2通過調控SLUG抑制TGF-β1誘導的EMT過程;關于頭頸癌一項研究稱，DEC2參與喚醒骨髓中的沉睡播散腫瘤細胞(DTCs)發(fā)生多器官轉移。綜上我們發(fā)現(xiàn)，DEC2在腫瘤細胞中發(fā)揮促癌或抑癌作用尚無定論。深入研究DEC2在胃癌惡性進程中

5、的作用及分子機制是本研究擬解決的關鍵問題。
　　研究目的:
　　為明確DEC2在胃癌惡性進程中的作用，我們通過免疫組織化學染色法檢測胃癌組織和癌旁正常胃組織樣品中DEC2的表達，并分析胃癌組織中DEC2表達水平與臨床病理參數(shù)及病人生存預后的相關性，探討其潛在的臨床價值;然后通過質粒轉染和慢病毒感染技術，獲得過表達或干擾DEC2的胃癌細胞株，檢測DEC2對胃癌細胞增殖、凋亡和侵襲轉移等惡性生物學行為的影響;并進行下游基因和分子

6、通路的篩選驗證，進一步揭示DEC2發(fā)揮腫瘤調控作用的分子機制，為探索DEC2可否作為胃癌治療的新靶點提供初步理論基礎。
　　研究方法:
　　1.免疫組織化學染色法檢測DEC2在胃癌組織及癌旁正常胃組織中的表達水平，依據(jù)免疫組化染色評分標準，統(tǒng)計分析組織樣本中DEC2表達水平與胃癌患者臨床病例參數(shù)之間的關系及其與E-cadherin表達的相關性;收集胃癌患者的預后隨訪資料，采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，應用Log

7、-rank檢驗統(tǒng)計DEC2和E-cadherin的表達水平與胃癌患者生存期之間的關系。
　　2.qPCR和Western blot法檢測DEC2在胃癌細胞株(HGC27、MGC803、BGC823、MKN-45)及永生化胃上皮細胞株(GES-1)中的表達水平，同時篩選出高表達和低表達DEC2的胃癌細胞株。選擇低表達DEC2的胃癌細胞株MGC803和MKN-45，通過慢病毒感染建立穩(wěn)定過表達DEC2的細胞株;選擇相對高表達DEC2的

8、胃癌細胞株HGC27，通過慢病毒感染建立穩(wěn)定干擾DEC2的細胞株。
　　3.CCK8和EdU實驗檢測DEC2對胃癌細胞增殖能力的影響;AnnexinV-FITC/PI流式細胞術檢測DEC2對胃癌細胞凋亡能力的影響;劃痕和Transwell侵襲和遷移實驗檢測DEC2對胃癌細胞侵襲遷移能力的影響。
　　4.選擇SPF級BALB/c Nude裸鼠，分別采用皮下注射和經(jīng)尾靜脈注射兩種方式，將穩(wěn)定過表達DEC2的胃癌細胞株DEC2/M

9、KN-45、穩(wěn)定干擾DEC2的胃癌細胞株DEC2-sh/HGC27及各對照組胃癌細胞株注入裸鼠體內。觀察DEC2對胃癌細胞體內增殖和轉移能力的影響。
　　5.鏡下觀察DEC2對胃癌細胞形態(tài)的影響，Western blot和細胞免疫熒光染色法檢測DEC2對上皮間質轉化(EMT)指標蛋白(N-cadherin、Vimentin、E-cadherin)的調節(jié)作用。
　　6.Western blot法檢測DEC2對ERK/NF-κB

10、通路相關靶蛋白表達水平的影響;通過加入ERK信號通路阻斷劑，觀察DEC2調節(jié)胃癌細胞上皮間質轉化和細胞侵襲遷移能力的變化。
　　研究結果:
　　1.DEC2在胃癌組織中低表達且與胃癌患者不良預后相關
　　DEC2在癌旁正常組織和胃癌組織中的陽性表達率分別為67.35％和22.45％(p＜0.05)，并且DEC2的表達與腫瘤浸潤(p=0.001)、淋巴管轉移(p=0.033)及TNM分期(p=0.001)呈顯著負相關;D

11、EC2在胃癌組織中的表達與E-cadherin的表達正相關(r=0.563，p＜0.001);高表達DEC2和E-cadherin組患者五年生存期顯著高于低表達DEC2和E-cadherin組(p=0.003)。
　　2.DEC2抑制胃癌細胞體外增殖及侵襲遷移
　　qPCR和Western blot法檢測結果顯示，DEC2在永生化胃上皮細胞株GES-1中的表達水平顯著高于胃癌細胞株(HGC27、MGC803、BGC823、M

12、KN-45)。DEC2本底表達量最低的胃癌細胞株MGC803和MKN-45過表達DEC2后，其增殖和侵襲遷移能力明顯受到抑制，而凋亡細胞比例增加;DEC2本底表達量相對較高的胃癌細胞株HGC27干擾DEC2表達后，其增殖和侵襲遷移能力明顯增強，而凋亡細胞比例減少。
　　3.DEC2抑制胃癌細胞體內成瘤及轉移
　　裸鼠皮下成瘤模型發(fā)現(xiàn)DEC2顯著抑制胃癌細胞成瘤及瘤體生長:過表達DEC2后，腫瘤生長速度明顯慢于對照組，瘤重小于

13、對照組;干擾DEC2表達后，腫瘤生長速度明顯快于對照組，瘤重大于對照組。
　　裸鼠經(jīng)尾靜脈注射轉移模型發(fā)現(xiàn)DEC2抑制胃癌細胞體內轉移:造模6周后取裸鼠肺組織，計數(shù)其表面腫瘤轉移灶，HE染色后觀察其病理形態(tài)。結果顯示，過表達DEC2組裸鼠肺組織轉移灶明顯少于對照組;干擾DEC2組裸鼠肺組織轉移灶明顯多于對照組。
　　4.DEC2抑制胃癌細胞上皮間質轉化(EMT)
　　鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，過表達DEC2后，胃癌細胞株DEC2/

14、MGC803和DEC2/MKN-45形態(tài)趨于卵石狀;然而，干擾DEC2表達后，胃癌細胞株DEC2-sh/HGC27形態(tài)無明顯變化。Western blot和細胞免疫熒光染色法檢測結果顯示:過表達DEC2后，DEC2/MGC803和DEC2/MKN-45細胞間質標志物N-cadherin和Vimentin的表達水平明顯減低，而上皮標志物E-cadherin的表達水平明顯升高;干擾DEC2表達后，DEC2-sh/HGC27細胞間質標志物N-

15、cadherin和Vimentin的表達水平明顯升高，而上皮標志物E-cadherin的表達水平明顯降低。
　　5.DEC2通過阻斷ERK/NF-κB通路抑制胃癌細胞發(fā)生EMT相關的侵襲轉移
　　Western blot檢測結果顯示:過表達DEC2后，DEC2/MGC803和DEC2/MKN-45細胞中ERK和NF-κB p65的磷酸化水平明顯降低，而E-cadherin的表達水平明顯升高;干擾DEC2表達后，DEC2-sh

16、/HGC27細胞中ERK和NF-κBp65的磷酸化水平明顯升高，而E-cadherin的表達水平降低。加入ERK通路抑制劑U0126后，在胃癌細胞株DEC2/MGC803、DEC2/MKN-45中，NF-κB p65的磷酸化水平以及其侵襲遷移能力進一步受到抑制，而E-cadherin的表達水平進一步升高。而在DEC2-sh/HGC27細胞中，U0126部分抵消了下調DEC2引起的NF-κB p65的磷酸化水平、侵襲遷移能力的升高和E-c