FOXD3通過調(diào)控miR-214及其靶基因參與結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移及放療抵抗的分子機制.pdf

1、目的：
　　本課題旨在揭示miR-214新的表達調(diào)控機制，闡明FOXD3/miR-214/靶基因軸在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用機制，為腫瘤診治提供新的思路及治療靶點。
　　方法：
　　1.結(jié)直腸癌組織和細胞中異常表達miRNAs篩選及驗證
　　利用miRNA芯片初步篩選出在結(jié)直腸癌組織和細胞中差異表達明顯且與轉(zhuǎn)移和放療相關(guān)的miR-214，利用熒光定量PCR驗證miR-214在結(jié)直腸癌組織和細胞中表達情況。

2、　　2.miR-214靶基因的預(yù)測和鑒定
　　以miR-214為關(guān)鍵詞，使用miRanda、TargetScan、Pictar和RNAhybrid數(shù)據(jù)庫對miR-214靶基因進行預(yù)測，挑選交集多且預(yù)測值高并通過查閱文獻尋找轉(zhuǎn)移和放療相關(guān)靶基因MED19和CDC25A，采用雙熒光素酶報告基因進行確定，并利用熒光定量PCR和Western blot檢測miR-214及其靶基因在六株結(jié)直腸癌細胞中的表達并進行相關(guān)性分析。
　　3.

3、miR-214對結(jié)直腸癌細胞生物學(xué)行為的影響
　　(1)設(shè)計并構(gòu)建miR-214慢病毒表達載體，進行慢病毒包裝，感染SW480和HCT116細胞，經(jīng)流式細胞儀分選穩(wěn)定表達的細胞株，利用熒光定量PCR驗證miR-214的表達;
　　(2)將miR-214慢病毒表達載體和不含3'UTR的兩個靶基因(MED19和CDC25A)編碼區(qū)表達慢病毒載體共轉(zhuǎn)染至SW480和HCT116細胞中，構(gòu)建穩(wěn)定表達的細胞株，利用Western bl

4、ot檢測MED19和CDC25A的表達變化;
　　(3)采用CCK-8、平板克隆、體外侵襲、Western blot及細胞免疫熒光實驗，檢測miR-214表達載體及miR-214和靶基因(不含3'UTR)共表達載體轉(zhuǎn)染后對結(jié)直腸癌細胞株SW480和HCT116體外增殖、侵襲及放療耐受的影響;
　　結(jié)果：
　　1.結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移及放療相關(guān)miRNA的篩選及鑒定
　　(1)送檢3張miRNA芯片結(jié)果表明，與正常結(jié)直腸粘

5、膜組相比，在結(jié)直腸癌組及遠處轉(zhuǎn)移組中共篩選出42個表達均下調(diào)的miRNA，其中包括miR-214。本課題組對結(jié)直腸癌SW837細胞8Gy放療前后送檢miRNA芯片，結(jié)果表明，與放療前比，放療后SW837細胞中miR-214表達顯著降低，提示miR-214與侵襲、轉(zhuǎn)移和放療密切相關(guān)。
　　(2)利用熒光定量PCR檢測30例配對新鮮結(jié)直腸癌組織中miR-214的表達，通過配對樣本T檢驗結(jié)果顯示:miR-214在結(jié)直腸癌組織中的表達顯著

6、低于正常粘膜組織(t=2.285，P＜0.001);進一步將30例結(jié)直腸癌組織分為伴遠處轉(zhuǎn)移組及不伴有轉(zhuǎn)移組，結(jié)果表明，miR-214在伴遠處轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌組織中的表達顯著低于不伴轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌組織(t=2.175，P＜0.001)。熒光定量PCR檢測miR-214在6種結(jié)直腸癌細胞株中的表達，單因素方差分析顯示，miR-214在5株細胞之間的差異，具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=114.632，P＜0.001)。SW480和HCT116細胞分別在0G

7、y、2Gy、4Gy、6Gy和8Gy劑量放療，24小時后收集細胞，熒光定量PCR檢測miR-214表達，結(jié)果表明，隨著放療劑量增加miR-214表達是逐漸降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=1029.532，P＜0.001; F=618.172，P＜0.001)。
　　2.miR-214靶基因的預(yù)測及鑒定
　　(1) miR-214轉(zhuǎn)移和放療抵抗相關(guān)靶基因的生物信息學(xué)預(yù)測
　　通過四個常用在線預(yù)測數(shù)據(jù)庫和查閱文獻預(yù)測與miR-

8、214相互作用的靶基因，結(jié)果顯示MED19（4個軟件均預(yù)測到）與增殖和轉(zhuǎn)移相關(guān)，CDC25A(2個軟件預(yù)測到)與放療相關(guān)。因此，我們假設(shè)MED19和CDC25A作為miR-214的靶基因。
　　(2)在HEK293A、SW480和HCT116細胞中，轉(zhuǎn)染psiCHECKTM-2-MED19-3'UTR載體結(jié)果顯示:與Mock組和MED19組比，miR-214/MED19共轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性均降低，具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=15.426，

9、P＜0.005; F=59.820，P＜0.001;F=73.500，P＜0.001)，表明miR-214能夠與MED193'UTR結(jié)合，從而抑制熒光素酶的活性;轉(zhuǎn)染psiCHECKTM-2-CDC25A-3'UTR載體結(jié)果顯示:與Mock組和CDC25A組比，miR-214/CDC25A共轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性均降低，具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=35.618，P＜0.010; F=313.848; P＜0.001; F=100.236，P＜0.0

10、01)，表明miR-214能夠與CDC25A3'UTR結(jié)合，從而抑制熒光素酶的活性。
　　(3) Western blot檢測MED19和CDC25A在6種結(jié)直腸癌細胞株中的表達，結(jié)果表明，MED19在HCT116、SW480、SW620、LOVO、LS174t和HT29細胞中表達逐漸降低;CDC25A在HCT116、SW480、LS174t、SW620、LOVO和HT29細胞中的表達是逐漸降低。
　　3.miR-214過表

11、達及回復(fù)靶基因后對結(jié)直腸癌細胞生物學(xué)行為的影響
　　(1)熒光定量PCR檢測SW480和HCT116細胞中miR-214組、Mock組、miR-214/MED19共轉(zhuǎn)染組和miR-214/CDC25A共轉(zhuǎn)染組中的miR-214表達變化，結(jié)果表明，SW480和HCT116細胞株中四組間miR-214的表達差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=47219.146，P＜0.001; F=17177.032，P＜0.001)。兩兩比較結(jié)果表明，與Mo

12、ck組相比，miR-214組中miR-214表達顯著增高，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001，P＜0.001)，而與miR-214組相比，miR-214/MED19和miR-214/CDC25A共轉(zhuǎn)染組中miR-214表達變化不明顯，差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.946，P=0.594;P=0.747，P=0.749)。結(jié)果表明miR-214轉(zhuǎn)染成功，并且MED19和CDC25A重新導(dǎo)入后，對miR-214的表達沒有明顯影響。
　　(

13、2) Western blot檢測SW480和HCT116細胞中Mock組、miR-214組、miR-214/MED19和miR-214/CDC25A共轉(zhuǎn)染組的MED19和CDC25A蛋白表達變化，結(jié)果表明，與Mock組相比，在miR-214組中MED19和CDC25A蛋白表達明顯下降，而分別重新轉(zhuǎn)染MED19和CDC25A后，MED19和CDC25A蛋白表達又上升。結(jié)果表明，miR-214能下調(diào)MED19和CDC25A蛋白表達。

14、>　　(3) CCK-8法檢測SW480和HCT116細胞中Mock組、miR-214組、miR-214/MED19和miR-214/CDC25A共轉(zhuǎn)染組的體外增殖能力并繪制細胞生長曲線。析因設(shè)計方差分析表明，MED19靶基因結(jié)果顯示:SW480和HCT116細胞株中時間與分組之間交互效應(yīng)有顯著性的差異，具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=52.77，P＜0.001;F=62.274，P＜0.001)，生長時間水平有顯著性的差異，具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=2

15、607.833，P＜0.001;F=35.355，P＜0.001)，三組間細胞增殖能力組間有顯著性的差異，具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=271.281，P＜0.001;F=4.376，P＜0.001)。兩兩比較結(jié)果表明:SW480細胞生長時間第4天、5天、6天和7天差異具有顯著性(P＜0.05)，細胞增殖能力組間3天、4天、5天、6天和7天差異具有顯著性（P＜0.05）。CDC25A靶基因結(jié)果顯示:SW480和HCT116細胞株中時間與分組之間交

16、互效應(yīng)有顯著性的差異，具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=43.861，P＜0.001;F=39.225，P＜0.001)，生長時間水平有顯著性的差異，具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=2170.620，P＜0.001; F=1501.804，P＜0.001)，組間細胞增殖能力有顯著性的差異，具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=227.617，P＜0.001; F=173.087，P＜0.037)。兩兩比較結(jié)果顯示:HCT116細胞生長時間第4天、5天、6天和7天差異具有顯著性(P

17、＜0.05)，細胞增殖能力組間4天、5天、6天和7天差異具有顯著性(P＜0.05)。以上結(jié)果表明，miR-214通過靶基因（MED19和CDC25A）抑制結(jié)直腸癌細胞體外增殖。
　　結(jié)論：
　　1、miR-214下調(diào)與結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移和放療敏感密切相關(guān)。
　　2、FOXD3/miR-214/MED19軸抑制結(jié)直腸癌增殖和侵襲轉(zhuǎn)移;
　　3、miR-214通過靶基因CDC25A增強結(jié)直腸癌放療抵抗能力。
　　本研