miR-214通過靶定Plexin-B1抑制腫瘤細胞的運動和增殖能力.pdf

1、目的： MicroRNA（miRNA）是一類新發(fā)現(xiàn)的能夠調(diào)控其靶基因表達水平的小RNA分子家族。近幾年已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并確定了上千種miRNA，目前miRNA的功能研究正日益成為生物學一個非?；钴S的研究領域。本研究旨在結(jié)合生物信息學、基因芯片及報告基因技術(shù)預測和確定miR-214在人類腫瘤細胞中的靶基因，并對miR-214通過調(diào)控靶基因而在腫瘤細胞中發(fā)揮的生物學功能進行進一步研究。 方法： 利用miRNA芯片技術(shù)對幾種

2、不同組織來源腫瘤細胞系中miR-214的表達水平進行比較，隨后在使用miR-214反義寡聚核苷酸特異性抑制細胞內(nèi)miR-214功能后，利用MTT法和軟瓊脂克隆形成實驗篩選分析miR-214對腫瘤細胞活性和增殖能力的影響。在此基礎上結(jié)合靶基因預測程序和mRNA表達譜芯片以及半定量RT-PCR的結(jié)果對miR-214的靶基因進行預測和篩選，并通過檢測GFP報告基因的方法進行驗證。隨后根據(jù)已知的該靶基因功能，應用腫瘤細胞運動能力實驗和測定生長曲

3、線的方法確定miR-214對腫瘤細胞運動能力和增殖能力的調(diào)控作用。 結(jié)果： 通過對miRNA芯片結(jié)果的分析發(fā)現(xiàn)在人類腫瘤細胞系HT-29，HeLa，MCF-7，A549，K562，ES-2中miR-214的表達都保持在較一致的水平。隨后利用MTI法和軟瓊脂克隆形成實驗對miR-214的功能進行篩選分析，發(fā)現(xiàn)在HeLa細胞中miR-214功能受到抑制后腫瘤細胞的活性和增殖能力均明顯增強。 在此基礎上利用長寡聚核苷酸

4、基因芯片（共7267個人類基因，包含凋亡相關基因、腫瘤相關基因、信號轉(zhuǎn)導相關基因、肝酶代謝相關基因、細胞因子相關基因）分析抑制miR-214的功能后mRNA表達譜的變化，選取部分表達有差異基因經(jīng)過半定量RT-PCR驗證，最終得到與芯片結(jié)果相符的基因有四個：Plexin-B1，MDH1，COX5A和RAC1。其中Plexin-B1是靶基因預測程序分析后認定的miR-214可能靶位點，在miR-214的功能被抑制后表達升高，我們通過檢測GF

5、P報告基因的方法確定了miR-214可以通過與Plexin-B13'UTR預測靶位點區(qū)域的直接相互作用抑制報告基因GFP的表達。 隨后，根據(jù)已知的該靶基因功能，一方面通過測定生長曲線確定了miR-214對腫瘤細胞增殖能力的抑制作用，另一方面利用腫瘤細胞趨化性運動能力實驗，證明了miR-214可以通過靶定：Plexin-B1而抑制腫瘤細胞的運動能力。 結(jié)論： 本文預測并首次確定了Plexm-B1是miR-214在人