miR-21通過(guò)靶定LRRFIP1調(diào)節(jié)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤對(duì)VM-26的敏感性.pdf

1、第二軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文miR21通過(guò)靶定LRRFIP1調(diào)節(jié)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤對(duì)VM26的敏感性姓名：李一明申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：神經(jīng)外科指導(dǎo)教師：盧亦成20090501第二軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文為了對(duì)靶基因的正確性進(jìn)行驗(yàn)證，我們先利用RTPCR和Westemblot技術(shù)檢測(cè)miR21功能被抑制后LRRFIPl的mRNA水平和蛋白水平的變化。實(shí)驗(yàn)表明，封閉miR21的功能后，LRRFIPl基因在mRNA水平和蛋白水平上都明顯上調(diào)，為了進(jìn)一步驗(yàn)

2、證miR21與LRRFIPl的作用關(guān)系，我們采用了綠色熒光蛋白(EGFP)報(bào)告載體實(shí)驗(yàn)，我們將預(yù)測(cè)到的LRRFIPl基因3’非編碼區(qū)與miR21互補(bǔ)結(jié)合的一段序列克隆插入報(bào)告基因EGFP的下游，構(gòu)建熒光報(bào)告載體，轉(zhuǎn)染U373MG細(xì)胞，同時(shí)封閉miR21的功能，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR21的功能被封閉后，EGFP的熒光強(qiáng)度明顯升高。而我們將報(bào)告載體中miR21的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變后，這種miR21變化導(dǎo)致的熒光強(qiáng)度變化不復(fù)存在。以上實(shí)驗(yàn)證明，LR

3、RFIPI是miR21的直接作用靶基因，受到miR21的特異性調(diào)控。LRRFIPl(也稱TRAF作用蛋白，TⅪP)是腫瘤壞死因子受體超家族的成員之一，包含一個(gè)RjNG手指序列和一個(gè)擴(kuò)展的coiledcoil區(qū)域。TR／P與腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子組成的信號(hào)復(fù)合體相互作用，抑制TRAF2介導(dǎo)的NF。rB活化途徑，減低其對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制作用。NFrB的活化是腫瘤拮抗化療藥物的主要機(jī)制之一。此外，抑制NFrB的活化后可增強(qiáng)腫瘤壞死因子a(n婚

4、口)或某些化療藥物對(duì)細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)抑制miR21的功能可增加靶基因LRRFIPl的上調(diào)，從而抑制NFrB的活化，導(dǎo)致膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物VM26敏感性增強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)首次分析了miR21與惡性膠質(zhì)瘤化療藥物耐藥之間的關(guān)系，機(jī)制可能是miR21通過(guò)抑制LRRFIPl基因，從而激活NFrd3通路來(lái)降低化療藥物的毒性作用。我們希望通過(guò)對(duì)miR21的功能的研究為惡性膠質(zhì)瘤的治療提供了新的思路和線索。但由于細(xì)胞和分子水平的調(diào)控