MIR-370通過靶向ENG調節(jié)子宮內膜樣卵巢癌細胞增殖和對cDDP敏感性機制的研究.pdf

1、目的：卵巢癌作為致命的婦科惡性腫瘤，造成每年在全世界范圍內大約12.5萬人死亡，近年來，卵巢癌的起始和進展包括在卵巢癌細胞中異常或失調的基因的分子機制研究正在深入進行。越來越多證據(jù)表明微RNA（miRNAs）與卵巢癌的惡性增殖程度相關，本論文發(fā)現(xiàn)miR-370在子宮內膜樣卵巢癌細胞中失調，從其宮內作用和其作用靶基因預測驗證兩個方面對其作用機制進行進一步的探究，進一步提供新的針對這種惡性腫瘤治療的策略的線索。
　　方法：本論文首先利

2、用qRT-PCR和Northern Blotting實驗檢測子宮內膜樣卵巢癌組織和細胞中的miR-370的異常表達，然后進行功能試驗檢測miR-370對子宮內膜樣卵巢癌的影響，利用細胞克隆形成實驗和MTT實驗檢測miR-370對子宮內膜樣卵巢癌細胞系IGROV1和TOV112D增殖能力的影響，利用Transwell實驗檢測miR-370對兩株子宮內膜樣卵巢癌細胞系IGROV1和TOV112D遷移能力的影響，利用流氏細胞儀檢測miR-37

3、0對子宮內膜樣卵巢癌細胞的細胞周期的影響，又利用Annexin V/PI雙染色法檢測miR-370對子宮內膜樣卵巢癌細胞的細胞凋亡的影響。
　　接下來本論文利用生物信息學軟件TargetScan和miRanda對miR-370作用的功能靶基因進行預測，預測到ENG基因是miR-370的靶標，接著首先本論文構建含有ENG基因3’UTR-wt的質粒，又利用雙熒光素報告基因對miR-370作用的直接靶基因進行驗證。
　　又進一步采

4、用Western Blotting和免疫組織化學的方法檢測miR-370與ENG蛋白表達量之間的關系，同時進一步驗證miR-370作用靶基因的方式及負相關性，文獻表明 ENG蛋白與藥物的耐藥性相關，計算 miR-370對子宮內膜樣卵巢癌細胞的IC50值，觀察miR-370對藥物耐藥性的影響。
　　最后又進行細胞水平的營救實驗證實 miR-370調節(jié)子宮內膜樣卵巢癌細胞的是通過靶向作用 ENG基因實現(xiàn)的，本論文又構建了穩(wěn)定表達 mi

5、R-370的IGROV1/miR-370細胞株，進行動物異體腫瘤移植模型，在體內水平同時證實了miR-370可以抑制子宮內膜樣卵巢癌細胞的增殖，以及miR-370對化療藥物cDDP的敏感性的影響。
　　結果：首先，與正常卵巢上皮細胞相比，miR-370在子宮內膜樣卵巢癌組織或細胞系中表達下調，表明miR-370可能在惡性腫瘤中具有潛在的腫瘤抑制基因的作用。功能實驗表明miR-370在子宮內膜樣卵巢癌細胞系IGROV1和TOV112

6、D中可以抑制細胞的增殖和細胞克隆形成，同時也能促進細胞的凋亡。
　　第二，MIR-370和 ENG在子宮內膜樣卵巢癌細胞系中表達呈負相關關系，miR-370可以直接靶向降低ENG蛋白的表達，，過度表達miR-370的子宮內膜樣卵巢癌細胞可使這些細胞對化療藥物順鉑更加敏感，進一步突出了miR-370的潛在的抗腫瘤作用。然而，當細胞經(jīng)另一種化療劑紫杉醇處理，miR-370并不影響其對子宮內膜樣卵巢癌細胞的敏感性。
　　第三，細胞

7、水平的營救實驗表明miR-370對子宮內膜樣卵巢癌細胞的增殖抑制和克隆形成能力的影響是通過影響ENG蛋白的表達而實現(xiàn)的。接下來的在體內動物異體腫瘤移植模型動物實驗結果表明，由過表達 miR-370的卵巢癌細胞 IGROV1成長起來的異體移植的腫瘤與對照組的腫瘤相比有一個更低的增長率。
　　這些有趣的結果引起了本論文去尋找鑒定miR-370的功能靶基因以及對miR-370和它的靶基因在上皮性卵巢癌的調控機制的研究。
　　結論: