糖原合酶激酶-3β對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖和化療敏感性的影響及雌、孕激素對(duì)其調(diào)節(jié)作用.pdf

1、卵巢癌是死亡率最高的婦科惡性腫瘤，盡管近年來(lái)手術(shù)和聯(lián)合化療已經(jīng)取得很大進(jìn)展，但是由于其發(fā)病機(jī)制至今尚不清楚，束縛了新療法的開(kāi)發(fā)，再加上棘手的化療耐藥問(wèn)題，因而卵巢上皮性癌的5年生存率一直未能提高。 許多惡性腫瘤都有一個(gè)共有的特征：葡萄糖代謝率的升高。大量葡萄糖的分解代謝不僅可以為腫瘤的快速生長(zhǎng)提供能量，而且可以為腫瘤細(xì)胞合成DNA、RNA和脂類提供前體物質(zhì)，因而腫瘤細(xì)胞中常存在糖代謝相關(guān)酶類的活性異常。其中糖原合酶激酶一3β(G

2、SK-3β)兼有調(diào)節(jié)葡萄糖代謝和調(diào)節(jié)其它轉(zhuǎn)錄因子、結(jié)構(gòu)蛋白活性等多種功能，故引起研究者們對(duì)其與腫瘤發(fā)展關(guān)系的廣泛研究。但是研究結(jié)論卻不一致，存在著不同的觀點(diǎn)。有關(guān)GSK-3B與卵巢癌的研究，更是鮮見(jiàn)報(bào)道。本課題從細(xì)胞增殖的角度入手，用體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，從細(xì)胞生長(zhǎng)曲線、BrdU摻入率、細(xì)胞克隆形成能力和裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)四個(gè)不同的方面來(lái)觀察GSK-31[3活性改變對(duì)卵巢癌細(xì)胞的短期和長(zhǎng)期影響；并通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞周期和細(xì)胞周期蛋白表達(dá)的變化以初步探討G

3、SK-3B影響卵巢癌細(xì)胞增殖的機(jī)制；同時(shí)觀察提高GSK-3β活性對(duì)卵巢癌細(xì)胞的化療增敏作用；最后，探討了在卵巢癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中有重要影響的雌、孕激素對(duì)GSK-3β活性的調(diào)節(jié)作用。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示GSK-3β可以影響卵巢癌細(xì)胞的增殖和化療敏感性，雌激素和孕激素可調(diào)節(jié)卵巢癌細(xì)胞GSK-3β的活性。 本課題共分三部分：(1)GSK-3β對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖的影響；(2)GSK-3β活性改變對(duì)卵巢癌細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)及其對(duì)化療增敏作用的研究；

4、(3)雌、孕激素對(duì)卵巢癌細(xì)胞GSK-3β活性的調(diào)節(jié)作用。 第一部分糖原合酶激酶-3β對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖的影響 目的探討糖原合酶激酶-3β(GSK-3β)對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖的影響。 方法以蛋白免疫印跡法檢測(cè)總GSK-3β和絲氨酸9位點(diǎn)磷酸化的GSK-3β(pGSK-3pSer9)在卵巢癌細(xì)胞株SKOV3和ES-2中的表達(dá)水平；采用細(xì)胞計(jì)數(shù)法描記細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，以檢測(cè)GSK-3β抑制劑對(duì)SKOV3和ES-2細(xì)胞生長(zhǎng)的影響；

5、將SKOV3細(xì)胞分成4組，將增加GSK-3β活性的質(zhì)粒GSK-3βS9A和其空載對(duì)照質(zhì)粒pCS2以及降低GSK-3β活性的質(zhì)粒GID5-6和其對(duì)照質(zhì)粒GID5-6LP，分別用電轉(zhuǎn)法與綠色熒光蛋白(GFP)質(zhì)粒，共同轉(zhuǎn)染入細(xì)胞中，采用5一溴脫氧尿嘧啶(BrdU)摻入實(shí)驗(yàn)檢測(cè)GSK-3β活性對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖的影響；利用G418篩選瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的SKOV3細(xì)胞得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株后，采用克隆形成實(shí)驗(yàn)，觀察改變GSK-3β的活性對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖的長(zhǎng)期影響

6、。用GSK-3β抑制劑LiCI或?qū)φ誑aCl處理SKOV3細(xì)胞后，分別注射于裸鼠皮下，每只裸鼠注射5×106個(gè)細(xì)胞，3周后處死裸鼠，取瘤稱重并用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的最長(zhǎng)徑和最短徑，計(jì)算腫瘤體積。 結(jié)果SKOV3和ES-2細(xì)胞均表達(dá)GSK-3β和pGSK-3βSer9，SKOV3細(xì)胞中pGSK-3β5er9的表達(dá)水平比ES-2低，而兩者總GSK-3β的表達(dá)水平相似。GSK-3β抑制劑可抑制SKOV3和ES-2細(xì)胞的生長(zhǎng)。與對(duì)照pCS

7、2相比，轉(zhuǎn)染GSK-3βS9A質(zhì)粒以上調(diào)GSK-3β的活性，可增加SKOV3細(xì)胞BrdU的摻入率；相反，與其對(duì)照GID5-6LP相比，轉(zhuǎn)染GID5-6質(zhì)粒來(lái)下調(diào)GSK-3β的活性，可減少SKOV3細(xì)胞BrdU摻入率。分別與各自的對(duì)照質(zhì)粒相比，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染GSK-3βS9A可形成較多的細(xì)胞克隆，而穩(wěn)定轉(zhuǎn)染GID5-6則形成的細(xì)胞克隆較少。與對(duì)照NaCl相比，LiCI可抑制SKOV3細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)。 結(jié)論GSK-3β具有促進(jìn)卵巢癌

8、細(xì)胞增殖的作用，抑制GSK-3β的活性可減少卵巢癌細(xì)胞的增殖。 第二部分GSK-3β活性改變對(duì)卵巢癌細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)及其對(duì)化療增敏作用的研究 目的探討GSK-3β調(diào)節(jié)卵巢癌細(xì)胞增殖的機(jī)理及其對(duì)化療敏感性的影響。 方法以電轉(zhuǎn)法將提高GSK-3β活性的GSK-3βS9A質(zhì)粒和降低GSK-3β活性的GID5-6質(zhì)粒及其相關(guān)對(duì)照質(zhì)粒與綠色熒光蛋白(GFP)質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染入卵巢癌細(xì)胞株SKOV3中，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行熒光分選，檢

9、測(cè)轉(zhuǎn)染了上述質(zhì)粒的細(xì)胞所處的細(xì)胞周期；用蛋白免疫印跡法檢測(cè)轉(zhuǎn)染上述質(zhì)粒對(duì)細(xì)胞周期蛋白cyclinD1表達(dá)的影響；采用碘化丙啶(PI)染色及熒光顯微鏡下觀察死亡細(xì)胞法篩選泰素敏感實(shí)驗(yàn)的適合濃度(即24hIC10)；以GSK-3βS9A質(zhì)粒和對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SKOV3細(xì)胞后，用適當(dāng)濃度的泰素處理細(xì)胞24h，采用PI染色并于熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)死亡細(xì)胞數(shù)，檢測(cè)泰素作用的敏感性。 結(jié)果轉(zhuǎn)染GSK-3pS9A質(zhì)粒，提高GSK-3β活性后，有45．

10、5+1.7％的SKOV3細(xì)胞進(jìn)入S期，而其轉(zhuǎn)染對(duì)照質(zhì)粒后只有37．5+2．9％的細(xì)胞進(jìn)入S期；相反，轉(zhuǎn)染GID5-6質(zhì)粒降低GSK-3β活性后，只有26．8±2．1％的SKOV3細(xì)胞進(jìn)入S期，而轉(zhuǎn)染對(duì)照質(zhì)粒后進(jìn)入S期的細(xì)胞百分比為36．3±1．5％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。轉(zhuǎn)染GSK-3βS9A質(zhì)?？缮险{(diào)細(xì)胞周期蛋白cyclinD1的表達(dá)，而轉(zhuǎn)染GID5-6質(zhì)?？上抡{(diào)cyclinD1的表達(dá)。泰素作用24h的ICl0為0．01μ

11、mol／L，用該濃度的泰素分別處理轉(zhuǎn)染了GSK-3pS9A質(zhì)粒及其對(duì)照質(zhì)粒的SKOV3細(xì)胞，PI染色顯示轉(zhuǎn)染GSK-3βS9A的細(xì)胞經(jīng)泰素處理24h后，有27．2±4．1％死亡，而轉(zhuǎn)染對(duì)照質(zhì)粒的細(xì)胞經(jīng)處理后，只有12．8±0．8％的細(xì)胞死亡，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．01)。 結(jié)論GSK-3β可通過(guò)上調(diào)cyclinD1的表達(dá)水平，促進(jìn)SKOV3細(xì)胞進(jìn)入S期，從而使卵巢癌細(xì)胞增殖。提高GSK-3β活性可增加SKOV3細(xì)胞對(duì)泰素的敏

12、感性。 第三部分雌、孕激素對(duì)卵巢癌細(xì)胞GSK-3β活性的調(diào)節(jié)作用 目的探討雌激素和孕激素對(duì)卵巢癌細(xì)胞GSK-3B活性的調(diào)節(jié)作用。 方法用含有10％活性炭處理的胎牛血清的無(wú)酚紅RPMI一1640培養(yǎng)基，預(yù)處理SKOV3細(xì)胞3天。將10-8mol／L、10-7mol／L或10-6mol／L的17-β雌二醇或醋酸甲羥孕酮孵育SKOV3細(xì)胞，以DMSO為對(duì)照，48h后用蛋白免疫印跡法檢測(cè)總GSK-3p和絲氨酸9位點(diǎn)磷酸化

13、的GSK-3β(pGSK-3pSet9)的表達(dá)水平。然后用10-6mol／L的17-β雌二醇或醋酸甲羥孕酮，處理24h、48h或72h后檢測(cè)總GSK-3β和pGSK-3βSer9的表達(dá)水平。 結(jié)果經(jīng)預(yù)處理后，17-β雌二醇可下調(diào)SKOV3細(xì)胞pGSK-3βSer9的表達(dá)水平，并隨著劑量的加大和時(shí)間的延長(zhǎng)，作用愈明顯。相反，醋酸甲羥孕酮孵育后SKOV3細(xì)胞pGSK-3pSet9的表達(dá)水平上升，并隨著劑量的加大和時(shí)間的延長(zhǎng)，作用更加