Mir-183-96-182簇調(diào)控膠質(zhì)細(xì)胞瘤中ROS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡及其對化療敏感性的影響.pdf

1、背景：很多miRNA在基因組中以簇的形式存在，序列相似、轉(zhuǎn)錄方向一致且協(xié)同發(fā)揮作用。miR-183、miR-96和miR-182共同構(gòu)成miR-183/96/182簇。miR-183/96/182簇的成員位于人類染色體7q32.2，相距4413bp內(nèi)且轉(zhuǎn)錄方向相同。這些miRNA轉(zhuǎn)錄于基因間區(qū)且有獨(dú)立的啟動子。這些miRNA的協(xié)同表達(dá)可能在人類生命活動的正常生理或病理?xiàng)l件下（包括腫瘤）發(fā)揮著重要的作用。人類miR-183/96/182簇

2、在多種腫瘤中高表達(dá)，且這種過表達(dá)對于膀胱癌、前列腺癌和尿細(xì)胞學(xué)搜檢來說是一種很好的標(biāo)志物。miR-183/96/182簇的多效性體現(xiàn)在可調(diào)節(jié)髓母細(xì)胞瘤的細(xì)胞存活、增殖和遷移。然而，miR-183/96/182簇的協(xié)同表達(dá)在膠質(zhì)瘤的發(fā)生和發(fā)展中的作用機(jī)制尚不清楚。
　　[miR-183/96/182簇調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖與凋亡]原位雜交及qRT-PCR均證實(shí)miR-183、miR-96和miR-182在腦膠質(zhì)瘤中高表達(dá)。在U251、

3、U87細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-183/96/182簇中的單個或全部miRNA mimics48h后進(jìn)行MTT分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-183/96/182簇可以促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖。而沉默miR-183/96/182簇中的單個或全部miRNA48h后進(jìn)行Hoechst染色檢測凋亡，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-183/96/182簇沉默促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡。因此，miR-183/96/182簇表達(dá)增加時促進(jìn)細(xì)胞增殖，而表達(dá)降低時促進(jìn)細(xì)胞凋亡。
　　

4、很多凋亡刺激因子導(dǎo)致的早期線粒體激活的特征，主要表現(xiàn)為呼吸相關(guān)蛋白的快速誘導(dǎo)及其迅速輸入線粒體參與線粒體呼吸、導(dǎo)致線粒體膜超極化和耗氧量增加。因此，我們用JC-1檢測了U251細(xì)胞中miR-183/96/182簇對線粒體膜電位(MMP，△ψm)的影響。結(jié)果顯示:在對照細(xì)胞組，線粒體膜電位高，JC-1表現(xiàn)為顯著的紅色熒光;miR-183/96/182簇沉默可以降低MMP，即綠色熒光增加;全部沉默組綠色熒光的強(qiáng)度最強(qiáng)，在單個沉默組中，miR

5、-96沉默對于細(xì)胞的MMP影響最為明顯。
　　[FGF9、CPEB1和FOXO1是miR-183/96/182簇的靶基因]已有文獻(xiàn)證實(shí)FOXO1是miR-183/96/182簇的靶基因。應(yīng)用在線軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF9、CPEB1亦是成熟miR-183、miR-96和miR-182的靶基因，熒光素酶分析實(shí)驗(yàn)證實(shí)了miR-183、miR-96和miR-182可分別與FGF9或CPEB1的3'-UTR區(qū)結(jié)合。U251細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-18

6、3/96/182簇中單個或全部miRNAmimics48h后抽取RNA及蛋白進(jìn)行qRT-PCR及Western Blot分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-183/96/182簇能降低其靶基因FGF9、CPEB1和FOXO1 mRNA和蛋白的表達(dá)，而沉默miR-183/96/182簇后FGF9、CPEB1和FOXO1mRNA和蛋白的表達(dá)均升高。
　　[miR-183/96/182簇通過靶基因FGF9、CPEB1和FOXO1對膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)R

7、OS生成的影響]在U251、U87細(xì)胞中過表達(dá)或沉默miR-183/96/182簇48h后，用熒光分光光度儀分析H2DCFDA(2'，7'-dichlorodihydrofuloresceindiacetate，2'，7'二氯雙氫熒光素二乙酸酯)染色的細(xì)胞數(shù)檢測細(xì)胞中ROS的含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-183/96/182簇后胞內(nèi)ROS的表達(dá)降低，而沉默miR-183/96/182簇后胞內(nèi)ROS的表達(dá)增加。用NAC(ROS的抑制劑)處理

8、miR-183/96/182簇沉默細(xì)胞組后，用同樣的方法分析細(xì)胞中ROS的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中ROS的含量降低。因此，過表達(dá)miR-183/96/182簇可以抑制ROS的生成，沉默miR-183/96/182簇可以促進(jìn)ROS的產(chǎn)生，然而ROS抑制劑NAC可以阻斷miR-183/96/182簇沉默對ROS生成的促進(jìn)作用。與miR-183、miR-96和miR-182 mimics的結(jié)果一致，干擾FGF9、CPEB1或FOXO1可以降低RO

9、S的生成且阻斷miR-183/96/182簇沉默對ROS生成的促進(jìn)作用。
　　[miR-183/96/182簇對AKT/P53凋亡信號通路的影響]AKT和P53信號通路是由ROS激活的兩個最重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。線粒體依賴的細(xì)胞凋亡途徑的活化可以通過AKT途徑激活ROS信號，而P53可以介導(dǎo)ROS誘導(dǎo)的抗增殖活性和早期衰老或凋亡。為了研究miR-183/96/182簇對AKT/P53/凋亡信號通路的影響，我們用Western Blo

10、t檢測了不同處理U87細(xì)胞中線粒體相關(guān)凋亡分子的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn):miR-183/96/182簇過表達(dá)時，p-AKT表達(dá)增加、P53表達(dá)降低、Bax表達(dá)降低、Bcl-2表達(dá)增加、Caspase9和細(xì)胞色素C均胞質(zhì)表達(dá)降低線粒體表達(dá)增加，抑制細(xì)胞凋亡;miR-183/96/182簇沉默時則與之相反。
　　干擾FGF9、CPEB1和FOXO1后，p-AKT表達(dá)降低，與miR-183/96/182簇過表達(dá)時的結(jié)果不一致;而P53的表達(dá)

11、降低與miR-183/96/182簇過表達(dá)時結(jié)果一致。這表明miR-183/96/182簇介導(dǎo)AKT磷酸化的過程不依賴其靶基因FGF9、CPEB1和FOXO1，而其介導(dǎo)p53表達(dá)降低則依賴其靶基因FGF9、CPEB1和FOXO1。因此，miR-183/96/182簇沉默誘導(dǎo)的ROS介導(dǎo)的AKT/凋亡途徑不依賴其靶基因FGF9、CPEB1和FOXO1，而該簇沉默誘導(dǎo)的ROS介導(dǎo)的P53/凋亡途徑依賴其上述三個靶基因。
　　[miR-

12、183/96/182簇沉默可增加膠質(zhì)瘤對化療的敏感性]為了研究miR-183/96/182簇沉默是否可以影響TMZ的藥理抑制作用，我們評估了不同處理U87細(xì)胞的抗癌效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn):TMZ可以促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)ROS的生成，且相較于未沉默處理組，miR-183/96/182簇沉默處理組細(xì)胞內(nèi)ROS生成更為顯著;TMZ可以促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡，且相較于未沉默處理組，miR-183/96/182簇沉默處理組細(xì)胞的凋亡更為顯著。因此，miR-18