ERK1-2通過調(diào)節(jié)GSH合成影響淋巴母細(xì)胞放射敏感性的初步研究.pdf

1、目的：
　　細(xì)胞內(nèi)的GSH含量對維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的氧化還原狀態(tài)，以及細(xì)胞的正常生理功能起著至關(guān)重要的作用，并且氧化還原狀態(tài)的變化可引起細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因轉(zhuǎn)錄發(fā)生改變。本研究通過觀察細(xì)胞內(nèi) ERK蛋白表達(dá)及其磷酸化改變對 GSH合成的影響，以及受X線照射后淋巴母細(xì)胞的存活率和 DNA損傷情況，來探討ERK蛋白對淋巴母細(xì)胞輻射敏感性的影響及其初步機(jī)制。
　　方法：
　　以人類淋巴母細(xì)胞TK6細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對象，選擇自由基(Fre

2、e Radical，F(xiàn)R)和活性氧(reactive oxygen species,ROS)清除劑 N-乙酰半胱氨酸(N-Acetyl Cysteine, NAC)、谷胱甘肽(Glutataione， GSH)的合成抑制劑丁硫氨酸亞砜亞胺(L-Buthionine-sulfoximine， BSO)和細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(Extracellular signal-regulated kinase1/2，ERK1/2)的特異性抑制劑P

3、D98059三種試劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。首先采用 MTT法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)藥物的濃度選擇，隨后以對數(shù)期生長的 TK6細(xì)胞通過分組，經(jīng)過各種試劑預(yù)處理后，采用GSH試劑盒檢測細(xì)胞內(nèi)GSH和GSSG的含量，并計(jì)算出還原型GSH的含量和GSH/GSSG比值，來觀察細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的改變。通過Western blot方法檢測，不同處理?xiàng)l件下細(xì)胞內(nèi)ERK蛋白和p-ERK蛋白的表達(dá)情況，以觀察不同氧化還原狀態(tài)對細(xì)胞內(nèi)ERK蛋白表達(dá)的影響。進(jìn)而，對經(jīng)不同預(yù)處理的各組

4、細(xì)胞進(jìn)行X線照射，照射劑量分別設(shè)定為0Gy、0.5Gy、2Gy和5Gy，采用CCK-8(Cell Counting Kit-8)試劑盒檢測受照射細(xì)胞的存活情況，并通過CB法對細(xì)胞內(nèi)的微核形成情況進(jìn)行觀察，計(jì)算細(xì)胞的微核形成率，以評價(jià)經(jīng)不同處理后，受照射細(xì)胞內(nèi)的DNA損傷程度。
　　結(jié)果：
　　MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，BSO和PD98059在TK6細(xì)胞的IC50值分別為500μmol/L和200μmol/L，故以20％IC50作為

5、BSO和PD98059的實(shí)驗(yàn)濃度，即BSO為100μmol/L，PD98059為40μmol/L。GSH檢測結(jié)果顯示，經(jīng)10mmol/L的NAC處理后，與對照組比較，TK6細(xì)胞內(nèi)的T-GSH和GSH含量增加，GSH/GSSG比值升高，而100μmol/L的BSO和40μmol/L的PD98059處理后，可引起細(xì)胞內(nèi)T-GSH和GSH含量的明顯減少，GSH/GSSG比值降低。Western Blot結(jié)果表明，PD98059能夠靶向抑制ER

6、K1/2蛋白的表達(dá)及其磷酸化，BSO可導(dǎo)致ERK1/2蛋白的磷酸化減少，而NAC并未顯著影響ERK1/2蛋白的表達(dá)及活化。后續(xù)經(jīng)CCK-8檢測的TK6細(xì)胞活性結(jié)果顯示，經(jīng)不同劑量的X線照射后，TK6細(xì)胞的活力下降，NAC預(yù)處理可保護(hù)受照射細(xì)胞的活性，而BSO及PD98059可進(jìn)一步減弱TK6細(xì)胞的活力，且在傳統(tǒng)照射劑量(2Gy)條件下，BSO的抑制作用更為明顯。經(jīng)微核形成情況的檢測，不同劑量的X線照射可明顯誘導(dǎo)TK6細(xì)胞內(nèi)微核形成的增加