MACC1基因沉默通過ERK通路對卵巢上皮性癌細胞順鉑敏感性的影響.pdf

1、背景
　　作為一種嚴(yán)重威脅女性健康和生命的惡性腫瘤，卵巢癌死亡率居婦科惡性腫瘤第一位。卵巢癌具有起病隱匿、發(fā)現(xiàn)晚、轉(zhuǎn)移早、進展快及預(yù)后差的特點。目前卵巢癌的發(fā)病機理仍不十分清楚。由于卵巢居于盆腔底部，所以卵巢癌缺乏早期特異性癥狀，患者因腹脹等原因就診時約70％已是晚期。晚期卵巢上皮性癌行腫瘤細胞減滅術(shù)和以鉑類為基礎(chǔ)的化學(xué)治療。腫瘤細胞減滅術(shù)旨在最大限度和范圍的切除腫瘤組織，但術(shù)后可能殘留的病灶仍然無法避免。因此，化療對晚期卵巢癌患

2、者來說必不可少。但部分患者對化療藥物尤其一線藥物順鉑耐藥卻造成治療失敗。化療耐藥又可分為內(nèi)在性耐藥和獲得性耐藥兩大類:約15％-25％的卵巢癌患者對以鉑類為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療方案內(nèi)在性耐藥，即為原發(fā)耐藥;而至少80％的接受化療的患者在治療過程中逐漸對順鉑產(chǎn)生耐藥性，稱為獲得性耐藥，即為繼發(fā)性耐藥?；熌退巼?yán)重制約著卵巢癌患者的生活質(zhì)量和生存期。因此，近年來，科學(xué)研究者在不斷尋找改善患者化療敏感性的方法。
　　2009年，Stein等在

3、結(jié)腸癌中發(fā)現(xiàn)了一個新的基因，因其與結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，因而這個基因被稱為結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因-1(Metastasis-associatedincoloncancer-1，MACC1)。MACC1是肝細胞生長因子(hepatocytegrowthfactor，HGF)/C-MET信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的重要調(diào)節(jié)因子，通過在轉(zhuǎn)錄水平上增強c-met的表達，在結(jié)腸癌的侵襲、轉(zhuǎn)移過程中起著重要作用。后來，國內(nèi)外科學(xué)研究者在多種人類惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)了MAC

4、C1的高表達，比如肝細胞癌、膽囊癌、胃癌、食管癌、乳腺癌、肺癌等。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，卵巢上皮性癌中MACC1mRNA及蛋白表達顯著高于其在卵巢良性腫瘤及正常卵巢組織中的表達;并合成了MACC1基因特異性shRNA，成功轉(zhuǎn)染人卵巢癌細胞OVCAR-3，通過一系列功能實驗發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后OVCAR-3細胞的增殖、遷移、侵襲能力減弱，而凋亡增加;通過RT-PCR和WesternBlot發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染細胞的C-met、p-ERK1/2、cyclinD1

5、、survivin、MMP9、MMP2及VEGFA等表達顯著減少，提示MACC1可能通過HGF/C-met信號通路及下游的MAPK通路來調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)的一系列基因表達來參與卵巢癌的惡性進展過程。但MACC1是否參與卵巢癌對順鉑敏感性的調(diào)節(jié)，目前國內(nèi)外尚無文獻顯示。
　　本研究通過RNA干擾(RNAinterferring，RNAi)技術(shù)分別抑制人上皮性卵巢癌細胞親本株SKOV3和相應(yīng)的順鉑耐藥株SKOV3/DDP細胞中MACC1表達

6、，應(yīng)用RT-PCR檢測細胞中MACC1基因的mRNA的表達情況，同時采用westernblot方法檢測MACC1、ERK1/2、p-ERK1/2、caspase-3及cleavedcaspase-3蛋白的表達，MTT法檢測細胞增殖及順鉑敏感性變化，Transwell法研究細胞體外侵襲能力的變化，探討MACC1基因抑制對上皮性卵巢癌細胞順鉑敏感性的影響，以及MACC1基因抑制后ERK通路蛋白的變化，試圖進一步了解MACC1是否通過ERK通

7、路對卵巢癌順鉑敏感性產(chǎn)生影響，并為尋求臨床上有效逆轉(zhuǎn)卵巢癌耐藥提供新的思路。
　　目的
　　通過RNA干擾技術(shù)分別抑制SKOV3和SKOV3/DDP細胞中MACC1表達，分析MACC1基因抑制后卵巢癌細胞增殖、凋亡及順鉑敏感性的變化，分析MACC1影響卵巢癌上述生物學(xué)行為的分子機制，為臨床上逆轉(zhuǎn)卵巢癌耐藥提供一個新的思路。
　　方法
　　1.前期設(shè)計的針對MACC1mRNA的小發(fā)卡狀RNA轉(zhuǎn)染卵巢癌細胞SKOV3

8、，RT-PCR及Westernblot分別檢測MACC1mRNA和蛋白表達，并檢測ERK1/2及p-ERK1/2蛋白含量的變化以及ERK通路抑制劑PD98059對上述蛋白水平的影響。MTT法評價細胞對順鉑化療敏感性的變化。
　　2.前期設(shè)計的針對MACC1mRNA的小發(fā)卡狀RNA轉(zhuǎn)染卵巢癌耐藥細胞SKOV3/DDP，RT-PCR及Westernblot檢測MACC1mRNA和蛋白表達，并檢測ERK1/2及p-ERK1/2、casp

9、ase-3及cleavedcaspase-3蛋白含量的變化以及ERK通路抑制劑PD98059對上述蛋白水平的影響。MTT法、FCM法和Transwell實驗分別評價細胞增殖能力和順鉑化療敏感性、凋亡的變化及細胞體外遷移能力的變化。
　　3.統(tǒng)計學(xué)處理:利用SPSS17.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計學(xué)分析。所得數(shù)據(jù)均以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±S）表示，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗，多個樣本均數(shù)兩兩比較采用LSD法方差分析。檢驗水準(zhǔn)α=0.05，以

10、p＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果
　　1.在SKOV3中，轉(zhuǎn)染MACC1shRNA的細胞可檢測到MACC1mRNA和蛋白的低表達;p-ERK1/2表達明顯降低，細胞的順鉑半數(shù)抑制濃度(IC50)明顯低于空白對照組和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組。在此基礎(chǔ)上加入PD98059后p-ERK1/2表達及IC50改變更為明顯。
　　2.MACC1沉默的SKOV3/DDP細胞中，MACC1mRNA和蛋白表達降低，p-ERK1/2及cas