卵巢透明細(xì)胞癌ES2細(xì)胞中ARID1A基因沉默對順鉑敏感性的影響及相關(guān)研究.pdf

1、研究目的:
　　體外設(shè)計并合成靶向于人ARID1A基因的siRNA，轉(zhuǎn)染人卵巢透明細(xì)胞癌ES2細(xì)胞，篩選出下調(diào)ARID1A表達(dá)的有效片段，研究ARID1A基因沉默對順鉑敏感性的影響，探討可能涉及的分子通路改變;研究蛋白激酶B抑制劑哌立福辛聯(lián)合順鉑對ES2細(xì)胞的體外增殖抑制作用，探討二者聯(lián)合的協(xié)同作用及可能的促凋亡機制，為今后卵巢透明細(xì)胞癌的分子靶向治療提供一定的理論依據(jù)。
　　研究方法:
　　體外合成各組siRNA并瞬

2、時轉(zhuǎn)染ES2細(xì)胞;利用RT-PCR法和westernblot法分別從mRNA和蛋白水平檢測ARID1A基因沉默情況，篩選出最佳片段(即siRNA-3)。使用siRNA-3片段瞬時轉(zhuǎn)染ES2細(xì)胞，24 h后加入不同濃度的順鉑，孵育48 h后采用CCK-8法檢測各實驗組半數(shù)抑制濃度(IC50);轉(zhuǎn)染后24 h加入相同濃度的順鉑50μM，孵育48 h后測得各組細(xì)胞生存率;采用流式細(xì)胞儀檢測各實驗組ES2細(xì)胞的凋亡率;采用western blo

3、t法檢測各實驗組ES2細(xì)胞中蛋白激酶B(AKT)表達(dá)水平的變化。
　　以不同濃度哌立福辛作用于ES2細(xì)胞48 h，采用CCK-8法檢測細(xì)胞增殖抑制情況;以哌立福辛最小有作用劑量與不同濃度順鉑聯(lián)合處理細(xì)胞48 h，以金氏公式篩選出協(xié)同抑制作用最明顯的聯(lián)合劑量，以該聯(lián)合劑量處理ES2細(xì)胞48 h，采用DAPI染色法及流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的凋亡情況;采用Giemsa染色法檢測細(xì)胞有絲分裂指數(shù);采用western blot法檢測細(xì)胞中Cas

4、pase-3(cleaved)及PARP(cleaved)蛋白表達(dá)水平的變化。
　　研究結(jié)果:
　　使用ARID1A特異性siRNA-3片段轉(zhuǎn)染ES2細(xì)胞后，CCK-8法結(jié)果顯示:siRNA-3組的IC50較siRNA-NC組和空白對照組均升高（均P＜0.05）;加入相同濃度的順鉑，siRNA-3組細(xì)胞生存率明顯高于siRNA-NC組和空白對照組(均P＜0.05)。流式結(jié)果顯示:siRNA-3聯(lián)合順鉑組細(xì)胞凋亡率明顯低于順鉑

5、組(P＜0.01)，siRNA-3組細(xì)胞凋亡率低于對照組(P＜0.05); western blot結(jié)果顯示:siRNA-3組中AKT蛋白表達(dá)水平較對照組升高（P＜0.01），順鉑組中AKT蛋白表達(dá)水平較對照組降低(P＜0.01)，siRNA-3聯(lián)合順鉑組中AKT蛋白表達(dá)水平較順鉑組升高(P＜0.05)。
　　CCK-8法檢測顯示:哌立福辛在48 h對ES2細(xì)胞的最小有作用劑量為4μM，以金氏公式計算結(jié)果提示4μM哌立福辛+40μ

6、M順鉑聯(lián)合用藥協(xié)同抑制細(xì)胞增殖作用最強;與哌立福辛或順鉑單獨作用組相比，DAPI染色發(fā)現(xiàn)聯(lián)合用藥組鏡下可見大量的細(xì)胞核碎裂;聯(lián)合用藥能夠協(xié)同增加細(xì)胞凋亡率;協(xié)同抑制細(xì)胞有絲分裂;聯(lián)合用藥能夠明顯增加細(xì)胞中Caspase-3(cleaved)蛋白的表達(dá)，降低PARP(cleaved)蛋白的表達(dá)(P＜0.01)。
　　研究結(jié)論:
　　采用siRNA干擾片段沉默卵巢透明細(xì)胞癌ES2細(xì)胞中ARID1A基因表達(dá)后能夠降低ES2細(xì)胞對順