雌二醇對卵巢透明細胞癌ES2細胞株增殖侵襲的影響及ARID1A、p53、MMP9蛋白表達變化的研究.pdf

1、目的：上皮性卵巢癌(EpithelialOvarianCancer，EOC)是女性三大惡性腫瘤之一，目前標準的治療方案是徹底的腫瘤細胞減滅術及以鉑類為基礎的化療。流行病學調查顯示，EOC患者多數(shù)已絕經(jīng)，但仍有40％左右的年輕患者因為手術或放化療而導致過早的醫(yī)源性絕經(jīng)。醫(yī)源性絕經(jīng)比自然絕經(jīng)對年輕婦女的影響更為強烈，主要涉及潮熱、出汗、陰道萎縮、性交困難、失眠、焦慮、抑郁，甚至引起骨質疏松、骨折和心血管疾病等，導致患者生活質量下降及非癌癥死

2、亡率的增加。雌激素作為絕經(jīng)激素治療（MHT）的一部分，對于治療絕經(jīng)綜合征、預防骨質疏松等，尤其是對于絕經(jīng)前的卵巢癌患者經(jīng)過手術或者化療之后，雌激素水平突然低落引起的絕經(jīng)癥狀，具有顯著效果。
　　目前，EOC的發(fā)病原因及機理仍不明了。一些研究認為，腫瘤的發(fā)生發(fā)展可能涉及癌基因激活、抑癌基因失活、凋亡抑制以及細胞周期失調等其中一種或多種基因的變化。關于抑癌基因突變引起腫瘤發(fā)生發(fā)展的研究一直受到關注，ARID1A作為染色質重塑復合物SW

3、I/SNF的一個亞基，在多種惡性腫瘤中存在突變，尤其是在卵巢透明細胞癌的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用。有研究顯示ARID1A可能與PI3K途徑存在相互作用，影響Akt的磷酸化水平，從而控制腫瘤細胞的增殖。降解細胞外基質（ECM）是惡性腫瘤細胞發(fā)生遠處轉移的重要步驟，基質金屬蛋白酶9(matrixmetalloproteinase--9，MMP9)是依賴Zn2?的基質金屬蛋白酶家族中的一員，又稱明膠酶B，它主要作用于Ⅳ、V、Ⅶ、X、Ⅺ型膠原以

4、及蛋白多糖、彈性蛋白和纖維連接蛋白等，通過降解細胞外基質及基底膜達到侵襲和轉移的作用。p53是在婦科惡性腫瘤中突變率較高的抑癌基因，野生型p53蛋白具有調控細胞周期、誘導細胞凋亡、抑制血管生成及促進DNA修復等作用。有研究顯示p53蛋白陽性率在卵巢癌組織中與癌旁正常組織存在顯著的差異性，提示p53蛋白異常表達與腫瘤細胞的增殖狀態(tài)和發(fā)展聯(lián)系密切。有研究發(fā)現(xiàn)p53可以與ARID1A/BRG1形成復合物并調節(jié)下游基因的轉錄，也可以同ARID1

5、A的羧基端相互作用，在細胞周期調節(jié)中起負性調節(jié)作用。有研究顯示卵巢透明細胞癌的發(fā)生與雌激素作用有一定關系，但是對于雌激素是否引起卵巢透明細胞癌復發(fā)的研究較少，雌激素在卵巢透明細胞癌患者術后的臨床安全應用仍然存在很多爭論。
　　本實驗通過檢測不同濃度17β-雌二醇（E2）作用于卵巢透明細胞癌ES2細胞后，細胞的增殖、侵襲、移行能力變化及ARID1A、p53、MMP9蛋白表達的情況，嘗試探索雌激素對卵巢透明細胞癌細胞可能存在的影響，為

6、卵巢透明細胞癌患者術后雌激素應用的安全性提供理論依據(jù)。
　　方法:用含10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基，在37℃、飽和濕度5%CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)人卵巢透明細胞癌ES2細胞。取對數(shù)生長期細胞用于實驗。實驗設立空白對照組（不含E2及溶劑）、溶劑對照組（加入0.01%vDMSO）以及E2組（10-7mol/L、10-8mol/L、10-9mol/L、10-10mol/L、10-1

7、1mol/L）。E2作用于ES2細胞前改用不含血清的無酚紅RPMI-1640培養(yǎng)基饑餓處理細胞24h。實驗至少分別重復3次。
　　1、細胞增殖實驗（MTS法）：對ES2細胞以不同濃度的E2（10-7mol/L，10-8mol/L，10-9mol/L，10-10mol/L，10-11mol/L）作用不同時間（24h，48h，72h），同時設空白對照組和溶劑對照組并觀察兩個對照組的區(qū)別。以細胞貼壁后，最初更換各組培養(yǎng)基的時間為0h，分

8、別在更換各組細胞培養(yǎng)基的24h、48h、72h，按10μl/孔加入MTS試劑，繼續(xù)培養(yǎng)1~4h。酶標儀檢測各孔490nm處的吸光度值，進行細胞增殖檢測分析。實驗至少重復3次。
　　2、細胞移行能力實驗：取實驗組和對照組細胞接種于transwell小室，每組設3復孔，連續(xù)培養(yǎng)24小時后，取出transwell小室，經(jīng)甲醇固定，結晶紫染色，在顯微鏡下（200×）計數(shù)移至微孔膜下層的細胞，33%醋酸進行抽提脫色10min，洗脫液在酶標儀

9、上570nm處檢測吸光度值。用于評估細胞的移行能力。
　　3、細胞侵襲實驗：實驗前先將50mg/LMatrigel膠按1:8稀釋，用稀釋液包被transwell小室底部聚碳酸酯膜的上室面，實驗組和對照組ES2細胞接種于上室，每組設3個復孔，培養(yǎng)24小時后，甲醇固定，結晶紫染色，顯微鏡下（200×）計數(shù)移至膜下層的細胞數(shù)評估細胞的侵襲能力。
　　4、蛋白印跡法（Westernblot）檢測對照組及不同濃度E2（10-7mol/

10、L，10-8mol/L，10-9mol/L，10-10mol/L，10-11mol/L）作用不同時間（48h，72h）后，ARID1A蛋白、p53蛋白和MMP9蛋白的表達。
　　5、應用SPSS21.0軟件進行統(tǒng)計學處理。計量資料數(shù)據(jù)以x±s描述，多組間均數(shù)差異性比較應用完全隨機設計方差分析（One-WayANOVA），若差別有統(tǒng)計學意義，采用SNK法進行組間的多重比較,所有假設檢驗水準為0.05，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義

11、。
　　結果:
　　1、MTS檢測E2作用于各組細胞24h、48h、72h后細胞的增殖能力，檢測的3個時間點內(nèi)，各組OD值經(jīng)完全隨機設計方差分析結果顯示P均小于0.05，三個時間點各組OD值差別有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。進一步對24h、48h、72h三個時間點的各組利用SNK法進行多重比較，各E2濃度（10-7mol/L，10-8mol/L，10-9mol/L，10-10mol/L，10-11mol/L）作用的ES2細胞

12、株與對照組相比，差別均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），呈現(xiàn)增殖能力增加。每一時間點的溶劑對照組與空白對照組相比，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。24h的時候，各濃度（10-7mol/L，10-8mol/L，10-9mol/L，10-10mol/L，10-11mol/L）之間差異沒有統(tǒng)計學意義（P>0.05）；48h和72h時，各濃度（10-7mol/L，10-8mol/L，10-9mol/L，10-10mol/L，10-11mol/L

13、）之間均有差別，增殖能力隨著E2濃度增加而增加（P<0.05）。見表1。
　　2、不同濃度的E2處理細胞后，檢測24h移行細胞吸光度值，經(jīng)完全隨機方差分析結果顯示P小于0.05，各組差別有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表2。Transwell移行實驗顯示，實驗組（73±6.2、65±4.7、61±3.5、58±1.1、58±2）穿膜細胞個數(shù)均多于對照組（46±1.5），差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表3。
　　3、Tr

14、answell侵襲實驗結果示，經(jīng)過不同濃度E2處理的ES2細胞，實驗組穿膜細胞個數(shù)多于對照組，經(jīng)完全隨機方差分析結果顯示P小于0.05，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。表3。
　　4、Westernblot實驗檢測各組ARID1A、p53和MMP9蛋白的表達水平：隨著E2濃度的升高，ARID1A的表達水平逐漸降低，MMP9和p53蛋白的表達隨著E2濃度的升高而增加。
　　結論:
　　1、E2處理ES2細胞后，細胞的增