EN2在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)及對(duì)人腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞生物行為的影響.pdf

1、腎細(xì)胞癌約占成人惡性腫瘤的2％，在我國(guó)居泌尿系腫瘤第二位，近幾十年來(lái)其發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。腎細(xì)胞癌起病隱匿，往往缺乏早期臨床表現(xiàn)。盡管由于診斷技術(shù)的改善使偶發(fā)性腎細(xì)胞癌的診斷率提高，依然有25％-30％的腎細(xì)胞癌患者在確診時(shí)已出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。腎細(xì)胞癌最主要治療方法是手術(shù)切除術(shù)，但術(shù)后復(fù)發(fā)率達(dá)25％～50％。腎細(xì)胞癌對(duì)放療和化療均不敏感;而免疫治療的療效有限。由于對(duì)VHL相關(guān)信號(hào)通路的深入研究腎細(xì)胞癌分子靶向治療取得很大進(jìn)展，這些藥物對(duì)于晚期

2、轉(zhuǎn)移性腎癌起到一定的緩解作用。但總的來(lái)說(shuō)，這些藥物對(duì)于轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌患者無(wú)進(jìn)展生存期和總生存率依然不盡人意。當(dāng)前研究表明，腎細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多因素、多基因異常及多階段的過(guò)程，積極探索腎細(xì)胞癌新的相關(guān)基因?qū)沂灸I細(xì)胞癌發(fā)生的分子機(jī)制和診治將提供新的線索和策略。近年來(lái)，關(guān)于同源異型盒基因與腫瘤的研究已經(jīng)成為抗癌研究中基因調(diào)控方面的一個(gè)熱點(diǎn)。Engrailed-2(EN2)基因?qū)儆诜洽耦愅串愋秃谢蚣易宄蓡T之一，人EN2基因位于染色

3、體7q36，編碼333個(gè)氨基酸。基因結(jié)構(gòu)由兩個(gè)外顯子和一個(gè)內(nèi)含子組成。EN2蛋白含有5個(gè)功能保守的亞區(qū)，從N末端到C末端分別命名為EH1-EH5。其中EH4為同源結(jié)構(gòu)域，是一個(gè)由61個(gè)氨基酸組成的序列，結(jié)構(gòu)和功能高度保守，與其它同源異型盒蛋白的同源結(jié)構(gòu)域具有相同的結(jié)構(gòu)。EN2的一個(gè)重要的生物學(xué)功能是作為轉(zhuǎn)錄因子與特定的DNA結(jié)合，從而在轉(zhuǎn)錄水平上起調(diào)節(jié)作用。EH1和EH5在轉(zhuǎn)錄抑制中起重要作用。而EH2和EH3可與另一個(gè)同源結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因

4、子PBX結(jié)合，影響EN2蛋白與不同的DNA結(jié)合的親和力，并決定其在調(diào)控轉(zhuǎn)錄過(guò)程中是起激活還是抑制作用。同源結(jié)構(gòu)域EH4亞區(qū)內(nèi)一個(gè)保守的輸出序列控制著EN2的分泌和攝取功能。這種分泌和攝取活動(dòng)是一個(gè)受到嚴(yán)格調(diào)控的過(guò)程。EN2是絲/蘇氨酸蛋白激酶2（CK2）的底物，CK2能使EN2蛋白的絲氨酸富集區(qū)的絲氨酸殘基磷酸化，從而抑制EN2的分泌和細(xì)胞間轉(zhuǎn)移。當(dāng)CK2表達(dá)水平低時(shí)，EN2的分泌和內(nèi)攝活動(dòng)增強(qiáng)，反之亦然。Engrailed基因在胚胎發(fā)

5、育過(guò)程中尤其在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中起著重要的作用，可能參與了發(fā)育中組織特定區(qū)域的空間完整性的建立與維持。在成年期表達(dá)異?？烧T發(fā)細(xì)胞的惡性增殖，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。既往研究發(fā)現(xiàn)EN2在人類乳腺癌細(xì)胞中異常表達(dá)。使正常的乳房細(xì)胞系中高表達(dá)EN2基因，可導(dǎo)致細(xì)胞周期明顯縮短，細(xì)胞接觸依賴性喪失。沉默人乳癌來(lái)源的細(xì)胞系中EN2的表達(dá)，處理后的細(xì)胞增殖速度降低。認(rèn)為EN2可能是乳腺癌的一種致癌基因。研究還發(fā)現(xiàn)EN2在前列腺癌細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)。通過(guò)siRN

6、A技術(shù)沉默EN2基因可下調(diào)PAX2的表達(dá)，并減緩前列腺癌細(xì)胞的增殖。前列腺癌及膀胱癌患者尿液中EN2蛋白含量增高，認(rèn)為尿液EN2檢測(cè)有望成為前列腺癌篩查及非肌層浸潤(rùn)膀胱癌診斷一種新的生物標(biāo)記物。然而，目前對(duì)于EN2基因在人腎透明細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展中的作用尚不清楚。本課題采用免疫組織化學(xué)、Wester blot、免疫熒光、RT-qPCR等技術(shù)研究EN2基因在腎透明細(xì)胞癌組織、癌旁無(wú)瘤組織、腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞株786-O及正常腎近曲小管細(xì)胞株H

7、K-2中的表達(dá)。并通過(guò)質(zhì)粒構(gòu)建及轉(zhuǎn)染技術(shù)，使786-O細(xì)胞過(guò)表達(dá)EN2基因，旨在研究EN2基因?qū)?xì)胞增殖、細(xì)胞分化周期及侵襲力等方面的影響。本課題的開(kāi)展將有助于拓展腎細(xì)胞癌致病機(jī)理的研究;為腎細(xì)胞癌的早期診斷、預(yù)后判斷及生物治療提供新的線索和手段。本研究分為四個(gè)部分：
　　 第一部分：EN2基因及蛋白在腎透明細(xì)胞癌組織中的表達(dá)。
　　 目的：EN2是同源異型盒基因家族成員之一，在一些腫瘤中呈高表達(dá)，可能發(fā)揮著癌基因作用，

8、但是在腎透明細(xì)胞癌中的作用不明。本研究探討同源異型盒基因EN2 mRNA及蛋白在人腎透明細(xì)胞癌組織中的表達(dá)差異及意義。
　　 方法：選取從2007年6月到2011年6月手術(shù)切除的腎透明細(xì)胞癌組織標(biāo)本作為實(shí)驗(yàn)組(n=35例)，選取切除的腎透明細(xì)胞癌組織癌旁無(wú)瘤腎實(shí)質(zhì)組織(n=35例)作為對(duì)照1組，選取因腎損傷行腎切除的正常成人腎實(shí)質(zhì)組織標(biāo)本（n=12例）作為對(duì)照2組。分別采用免疫組織化學(xué)(Immunohistochemistry，

9、IHC)、Western blot技術(shù)檢測(cè)EN2蛋白在上述組織中表達(dá)。同時(shí)從上述腎透明細(xì)胞癌組織及癌旁無(wú)瘤腎實(shí)質(zhì)組織中分別選取12例，液氮冷凍保存，采用RT-qPCR(Real-timequantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)技術(shù)檢測(cè)EN2 mRNA在上述組織中表達(dá)。并對(duì)實(shí)驗(yàn)組手術(shù)后的患者進(jìn)行隨訪。35例患者中33例獲得隨訪，隨訪時(shí)間為12～66個(gè)月。
　　 結(jié)果：EN2 m

10、RNA及蛋白在正常腎近曲小管和遠(yuǎn)曲小管細(xì)胞中高表達(dá)。EN2蛋白在腎透明細(xì)胞癌組織、癌旁無(wú)瘤腎組織及正常成人腎組織中陽(yáng)性表達(dá)率分別為22.8％，100％和100％，經(jīng)x2檢驗(yàn)(Fisher's Exact Test)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=59.39，P=0.000)。EN2蛋白主要定位于正常腎小管上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中。此外，在腎小管及集合管管腔內(nèi)可見(jiàn)大量的EN2蛋白染色顆粒。而腎小管之間的間質(zhì)細(xì)胞及腎小球、腎小囊內(nèi)均未見(jiàn)EN2

11、蛋白染色。只在小部分腎透明細(xì)胞癌組織的細(xì)胞質(zhì)中見(jiàn)EN2蛋白染色。通過(guò)Spearman等級(jí)相關(guān)檢驗(yàn)顯示腎透明細(xì)胞癌EN2蛋白染色評(píng)分與腎透明細(xì)胞癌病理學(xué)分級(jí)存在負(fù)相關(guān)（Spearman相關(guān)系數(shù)為-0.382，P=0.023）。腎透明細(xì)胞癌EN2蛋白染色評(píng)分與患者性別（Spearman相關(guān)系數(shù)為0.074，P=0.674）、年齡（Spearman相關(guān)系數(shù)為0.126，P=0.473）、腫瘤大小(Spearman相關(guān)系數(shù)為0.193，P=0.

12、266)、腫瘤分期（Spearman相關(guān)系數(shù)為0.077，P=0.660）等因素未存在相關(guān)關(guān)系。RT-qPCR檢測(cè)顯示EN2 mRNA在12例腎透明細(xì)胞癌組織中低表達(dá)，癌旁無(wú)瘤腎組織EN2 mRNA含量(2(-△△Ct)=6.62±3.26)為腫瘤組織(2(-△△Ct)=1.75±0.75)的3.9倍(t=4.863，P=0.001)。Western blot檢測(cè)顯示12例腫瘤組織及12例癌旁無(wú)瘤腎實(shí)質(zhì)組織灰度值分別為177.14±10

13、0.23和367.46±207.92。經(jīng)配對(duì)資料t檢驗(yàn)，t=5.362，P=0.000，認(rèn)為癌旁無(wú)瘤腎實(shí)質(zhì)組織中EN2蛋白表達(dá)水平較腎透明細(xì)胞癌增高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論：EN2 mRNA及蛋白在正常腎近曲小管和遠(yuǎn)曲小管細(xì)胞中高表達(dá)，EN2蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中。此外，在癌旁無(wú)瘤腎組織及成人正常腎組織之腎小管及集合管管腔內(nèi)可見(jiàn)EN2蛋白染色顆粒，而在腎小球及腎小囊內(nèi)均未見(jiàn)EN2蛋白染色，提示EN2蛋白可被正常腎小管

14、上皮細(xì)胞分泌至腎小管內(nèi)，參與尿液的形成。對(duì)比在正常腎近曲小管和遠(yuǎn)曲小管細(xì)胞，同源異型盒基因mRNA及蛋白在腎透明細(xì)胞癌旁組織呈低表達(dá)或表達(dá)缺失，且為異位表達(dá)。EN2蛋白表達(dá)水平與腎透明細(xì)胞癌病理分級(jí)存在負(fù)相關(guān)關(guān)系。
　　 第二部分：EN2基因及蛋白在人腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞中的表達(dá)。
　　 目的：探討同源異型盒基因EN2 mRNA及蛋白在人腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞株786-O及人正常腎小管上皮細(xì)胞株HK2之間的表達(dá)差異。
　　

15、 方法：體外培養(yǎng)腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞株786-O作為實(shí)驗(yàn)組，培養(yǎng)人正常腎小管上皮細(xì)胞株HK-2作為對(duì)照組，分別采用免疫熒光、Western blot和RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)EN2 mRNA及蛋白在上述細(xì)胞中的表達(dá)差異。
　　 結(jié)果：Western blot分析顯示EN2蛋白在腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞株786-O和正常腎小管細(xì)胞株HK-2中的灰度值分別為24.15和1031.29。免疫熒光檢測(cè)顯示EN2在入正常腎小管上皮細(xì)胞中高表達(dá)，EN2蛋

16、白定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中。RT-qPCR分析顯示EN2 mRNA在正常腎小管細(xì)胞株HK-2(2(-△△Ct)=1.26±0.19)中的表達(dá)是腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞株786-O(2(-△△Ct)=1.0±0.11）的1.2倍。但經(jīng)兩樣本t檢驗(yàn)，兩組細(xì)胞EN2 mRNA水平差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.85，P=0.065）。
　　 結(jié)論：同源異型盒基因EN2 mRNA及蛋白在正常腎小管細(xì)胞株HK-2呈高表達(dá)，蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，而在

17、腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞株786-O中表達(dá)下調(diào)。與EN2在人腎透明細(xì)胞癌組織中的表達(dá)一致。
　　 第三部分：EN2基因真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及高表達(dá)EN2的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的建立和鑒定。
　　 目的：構(gòu)建pcDNA3.1+EN2真核表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染低表達(dá)EN2基因的腎透明細(xì)胞癌786-O細(xì)胞株，使之穩(wěn)定、高表達(dá)該基因，并對(duì)其進(jìn)行鑒定，為探索EN2基因高表達(dá)在人腎透明細(xì)胞癌中的生物學(xué)功能提供穩(wěn)定實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株。
　　 方法：通過(guò)RT-

18、PCR擴(kuò)增人EN2基因編碼區(qū)全長(zhǎng)序列，采用DNA重組技術(shù)將該基因片段重組于pcDNA3.1+真核表達(dá)質(zhì)粒上。構(gòu)建pcDNA3.1+EN2重組真核表達(dá)質(zhì)粒，通過(guò)PCR擴(kuò)增、酶切電泳分析及DNA測(cè)序的方法對(duì)重組DNA進(jìn)行鑒定。將EN2基因的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1+EN2和空載體質(zhì)粒pcDNA3+采用脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法分別轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的人腎透明細(xì)胞癌786-O細(xì)胞。篩選出穩(wěn)定表達(dá)EN2的786-O細(xì)胞株，以pcDNA3.1+EN2轉(zhuǎn)染細(xì)胞

19、為實(shí)驗(yàn)組，pcDNA3.1+轉(zhuǎn)染組及未轉(zhuǎn)染786-O細(xì)胞組為對(duì)照，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot法檢測(cè)EN2基因的表達(dá)。
　　 結(jié)果：成功將EN2基因克隆至真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)。酶切電泳分析、PCR和測(cè)序鑒定結(jié)果表明，插入EN2基因的序列與GenBank上的人EN2基因mRNA序列完全相符。pcDNA3.1+EN2表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染786-O細(xì)胞后，篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)EN2基因的786-O細(xì)胞株。RT-q

20、PCR結(jié)果經(jīng)析因設(shè)計(jì)的方差分析顯示，pcDNA3.1+EN2重組體轉(zhuǎn)染組細(xì)胞與兩對(duì)照組比較，其細(xì)胞的EN2 mRNA表達(dá)量增加，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=571.48，P=0.000)。Western Blot檢測(cè)結(jié)果經(jīng)單因素方差分析顯示實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞EN2蛋白表達(dá)水平增高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，F(xiàn)=6.861，P=0.028。提示轉(zhuǎn)染成功。
　　 結(jié)論：構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1+EN2，成功轉(zhuǎn)染并篩選出穩(wěn)定的高表達(dá)EN2基因的人

21、腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞株786-O，為EN2對(duì)人腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞生物學(xué)性狀影響的深入研究提供了理想的實(shí)驗(yàn)細(xì)胞模型。
　　 第四部分：EN2對(duì)人腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。
　　 目的：在前期的研究的基礎(chǔ)上，研究低表達(dá)EN2基因的人腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞786-O在成功轉(zhuǎn)染pcDNA3.1+EN2真核表達(dá)質(zhì)粒后其細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲及遷徙等生物學(xué)性狀的變化。
　　 方法：成功構(gòu)建pcDNA3.1+EN2真核表達(dá)質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)

22、染、篩選穩(wěn)定的高表達(dá)EN2基因的人腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞。以pcDNA3.1+EN2轉(zhuǎn)染細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組，pcDNA3.1+轉(zhuǎn)染組及未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞為對(duì)照，采用MTS、流式細(xì)胞儀及細(xì)胞穿膜等實(shí)驗(yàn)技術(shù)研究高表達(dá)EN2基因的人腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲及遷徙等生物學(xué)性狀的變化。
　　 結(jié)果：MTS法分析顯示，在轉(zhuǎn)染一天后，三組細(xì)胞OD值分別為0.54±0.03、0.64±0.02和0.72±0.01。兩天后，三組細(xì)胞OD值分別為0.84±0

23、.02、1.07±0.04和1.1±0.08。三天后，三組細(xì)胞OD值分別為1.13±0.05、1.59±0.08和1.58±0.06。采用析因設(shè)計(jì)的方差分析顯示三組細(xì)胞OD值差別(F=111.73，P=0.000)，不同時(shí)間點(diǎn)之間細(xì)胞OD值差別(F=599.83，P=0.000)及交互作用(F=10.94,P=0.000)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與兩對(duì)照組細(xì)胞比較，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞OD值降低，提示上調(diào)EN2蛋白可減慢人腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞786-O的增殖

24、活性。流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示實(shí)驗(yàn)組相對(duì)于兩對(duì)照組，細(xì)胞凋亡率增加，活性細(xì)胞數(shù)明顯減少。pcDNA3.1+EN2轉(zhuǎn)染組、pcDNA3.1+轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡比例分別為2.93％±0.92、1.01％±0.33和0.51％±0.17。采用析因設(shè)計(jì)的方差分析顯示三組細(xì)胞凋亡率差別（F=72.72, P=0.000），不同時(shí)間點(diǎn)之間差別(F=17.91，P=0.000)及交互作用(F=9.76, P=0.000)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與兩對(duì)照組細(xì)胞

25、比較，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率增加，提示EN2基因高表達(dá)可增強(qiáng)786-O細(xì)胞凋亡。細(xì)胞穿膜實(shí)驗(yàn)顯示轉(zhuǎn)染48h，pcDNA3.1+EN2轉(zhuǎn)染組、pcDNA3.1+轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組786-0細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)分別為1.38±2.2、59.00±26.73和31.50±15.47，單因素方差分析顯示，pcDNA3.1+EN2轉(zhuǎn)染組穿膜細(xì)胞數(shù)與兩對(duì)照組之間不同(F=20.80，P=0.000)，pcDNA3.1+EN2轉(zhuǎn)染組穿膜細(xì)胞數(shù)在轉(zhuǎn)染后第二天少于兩對(duì)