SET8在腎透明細胞癌組織中的表達及其沉默后對細胞生物學行為的影響.pdf

1、目的：腎癌（renal cell carcinoma，RCC）是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，占成人惡性腫瘤的2~3％，其中腎透明細胞癌（clear cell renal cell carcinoma，ccRCC）約占70%。RCC患者起病隱匿，確診時20%~30%的患者已有遠處轉(zhuǎn)移。RCC的發(fā)生、發(fā)展是一個多因素、多階段和多基因參與的生物學過程，但臨床上對其發(fā)生、發(fā)展一直缺乏有效的檢測與治療方法。SET8是現(xiàn)今發(fā)現(xiàn)唯一能夠特異性單甲基化組蛋

2、白 H4賴氨酸20位（Histone H4 lysine20，H4K20）的賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶，參與調(diào)控細胞周期、染色質(zhì)結構及基因轉(zhuǎn)錄。近年來，其在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中所起的作用備受關注。SET8在多種腫瘤組織中表達上調(diào)，并參與調(diào)控腫瘤相關基因的表達，臨床研究發(fā)現(xiàn)SET8表達水平影響肝癌、非小細胞肺癌患者的預后，提示SET8在腫瘤發(fā)生及侵襲、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，但目前對于SET8基因及其蛋白表達在ccRCC發(fā)生、發(fā)展中的作用尚不清楚，因此本研

3、究旨在探討SET8表達水平與ccRCC患者臨床病理特征的關系，通過體外細胞學實驗明確SET8對ccRCC786-O細胞增殖轉(zhuǎn)移的影響及其可能機制。
　　方法：
　　1、免疫組織化學法檢測ccRCC組織標本SET8蛋白表達情況及其與ccRCC患者臨床病理特征的關系。
　　2、體外培養(yǎng)ccRCC786-O細胞，針對人SET8基因設計合成4對候選短發(fā)夾RNA（shRNA）序列(shRNA1，shRNA2，shRNA3，shR

4、NA4)，以lipofectamine2000為載體，轉(zhuǎn)染ccRCC786-O細胞，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率，Western blot檢測786-O細胞SET8蛋白的表達，篩選有效shRNA序列。將有效 shRNA序列轉(zhuǎn)染786-O細胞，細胞分3組：（1） SET8-shRNA轉(zhuǎn)染組(轉(zhuǎn)染 SET8-shRNA)；（2）陰性對照轉(zhuǎn)染組（轉(zhuǎn)染陰性對照shRNA）；(3)正常對照組（未轉(zhuǎn)染組）。
　　3、MTT法檢測786-O細胞增殖

5、能力；平板克隆形成實驗檢測細胞克隆形成能力；劃痕實驗檢測786-O細胞遷移能力；Transwell小室實驗檢測786-O細胞侵襲能力。
　　4、RT-PCR檢測各組細胞wnt通路相關基因β-catenin、c-myc、MMP7 mRNA表達情況。
　　5、統(tǒng)計學方法應用SPSS21.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計學處理，計量資料以（x±s）表示，SET8蛋白表達水平與ccRCC患者臨床病理特征的關系采用χ2檢驗，兩組間均數(shù)比較采用t檢

6、驗，多組間均數(shù)比較采用方差分析。P<0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果：1.SET8蛋白表達與ccRCC患者臨床病理特征的關系：156例ccRCC組織中，SET8蛋白陽性表達154例，占98.7%(154/156)；SET8蛋白高表達者94例，占60.3%(94/156)，低表達者為62例，占39.7%(62/156)。SET8蛋白表達與腫瘤分期、腫瘤大小及淋巴結轉(zhuǎn)移關系密切（均 P<0.05），但與 ccRCC患者的性別、

7、年齡無統(tǒng)計學差異（均P>0.05）；2.RNA干擾技術沉默 SET8在786-O細胞中的表達：在SET8-shRNA濃度為2ug/L、lipofectamine2000為4ul/孔轉(zhuǎn)染條件下，轉(zhuǎn)染效率約70%；篩選最佳干擾序列為SET8-shRNA2，轉(zhuǎn)染48h沉默效率可達64%。SET8-shRNA2轉(zhuǎn)染組SET8蛋白表達在轉(zhuǎn)染后48h顯著低于陰性對照轉(zhuǎn)染組、正常對照組（t=-38.174，P<0.01；t=-58.766，P<0.0

8、1）；3.SET8基因沉默抑制786-O細胞增殖和克隆形成能力：MTT結果顯示：與陰性對照轉(zhuǎn)染組和正常對照組相比，SET8-shRNA2轉(zhuǎn)染組MTT吸光度值在轉(zhuǎn)染后24、48h明顯下降（均P<0.05）。SET8-shRNA組的克隆形成數(shù)目顯著低于陰性對照轉(zhuǎn)染組和正常對照組（均P<0.05），且克隆體積亦較小，而后兩組比較無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；4.SET8基因沉默抑制786-O細胞遷移侵襲能力：沉默SET8基因后ccRCC細胞劃

9、痕愈合速度明顯慢于陰性對照轉(zhuǎn)染組和正常對照組（均 P<0.05）,SET8-shRNA組細胞遷移抑制率為66.7%，癌細胞遷移率明顯減低。Transwell小室實驗結果顯示，與陰性對照轉(zhuǎn)染組、正常對照組相比，SET8基因沉默后786-O細胞侵襲細胞數(shù)明顯降低（P<0.05）；5.SET8基因沉默抑制wnt信號通路相關基因c-myc、MMP7 mRNA的表達：與陰性對照轉(zhuǎn)染組、正常對照組相比，沉默 SET8基因表達后，wnt靶基因 c-m