mGluR6通過ERK通路調(diào)節(jié)人角質(zhì)形成細(xì)胞的吞噬功能.pdf

1、目的:探討代謝型谷氨酸受體6調(diào)節(jié)人角質(zhì)形成細(xì)胞吞噬作用的分子機(jī)制。
　　方法:1、人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞系(HaCaT細(xì)胞)的體外培養(yǎng)、凍存和復(fù)蘇。
　　2、Western blot法檢測HaCaT細(xì)胞中代謝型谷氨酸受體6(metabotropic glutamate receptor6，mGluR6)蛋白水平的表達(dá)。
　　3、構(gòu)建慢病毒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系:將下調(diào)mGluR6基因的慢病毒載體轉(zhuǎn)染至人角質(zhì)形成細(xì)胞系，并建立穩(wěn)定

2、低表達(dá)細(xì)胞系(HaCaT-mGluR6)，同時(shí)建立空病毒載體對(duì)照組(HaCaT-NC)。
　　4、Western blot法檢測HaCaT細(xì)胞中mGluR6的敲低效率。
　　5、運(yùn)用激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞骨架蛋白F-actin在下調(diào)mGluR6的HaCaT細(xì)胞中的分布及變化。
　　6、Western blot法檢測HaCaT、HaCaT-NC、HaCaT-mGluR6各組細(xì)胞中pERK、ERK水平的表達(dá)。
　　

3、7、Western blot法檢測HaCaT、HaCaT-NC、HaCaT-mGluR6各組細(xì)胞中pCaM KⅡ、CaMKⅡ水平的表達(dá)。
　　8、Western blot法檢測HaCaT、HaCaT-NC、HaCaT-mGluR6各組細(xì)胞中pMLC、MLC水平的表達(dá)。
　　結(jié)果:1、HaCaT細(xì)胞表達(dá)mGluR6且表達(dá)量豐富。
　　2、成功構(gòu)建穩(wěn)定下調(diào)mGluR6的HaCaT細(xì)胞，敲低效率達(dá)到～80％。
　　3、

4、運(yùn)用激光共聚焦顯微鏡觀察到下調(diào)mGluR6的HaCaT細(xì)胞與對(duì)照組相比，細(xì)胞骨架蛋白F-actin重新分布，細(xì)胞周邊表達(dá)量較少，核周增多。
　　4、下調(diào)mGluR6的HaCaT細(xì)胞中pERK的表達(dá)量較對(duì)照組降低，ERK的表達(dá)量大致相同，pERK/ERK的比值明顯降低。
　　5、下調(diào)mGluR6的HaCaT細(xì)胞中pCaM KⅡ的表達(dá)量較對(duì)照組降低，CaM KⅡ的表達(dá)量大致相同，pCaM KⅡ/CaM KⅡ的比值明顯降低。