FGF21通過FGFR1-ERK1-2通路抑制HepG2細(xì)胞apo(a)表達(dá).pdf

1、動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是心血管疾病發(fā)生主要的病理生理基礎(chǔ)，而血漿中高水平的脂蛋白(a)是動脈粥樣硬化發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因子，但目前尚缺乏專一有效的方法下調(diào)高脂蛋白(a)病人血漿中的脂蛋白(a)水平。載脂蛋白(a)[apolipoprotein(a),apo(a)]是脂蛋白(a)的特有組成部分，大量的研究表明其合成量的高低及其分子量的大小直接關(guān)系到血漿中脂蛋白(a)的水平。因此，如何抑制apo(a)的合成，成為目

2、前降低血漿中脂蛋白(a)的主要策略。最新的研究發(fā)現(xiàn)在apo(a)的啟動子區(qū)域存在一個(gè)Ets-1及DR-1的結(jié)合位點(diǎn)，活化的Elk1及HNF4α分別與這兩個(gè)位點(diǎn)結(jié)合從而調(diào)控apo(a)的轉(zhuǎn)錄。Elk1作為ERK1/2的一個(gè)下游因子其可被磷酸化的ERK1/2所激活，而磷酸化的ERK1/2還可抑制HNF4α表達(dá)。成纖維細(xì)胞因子21(Fibroblast growth factor21, FGF21)作為調(diào)節(jié)肝臟代謝的重要因子，研究表明其可以通

3、過ERK1/2信號通路參與肝臟糖脂代謝的調(diào)節(jié)，并影響血漿中脂蛋白水平，而這些作用由FGFR1-β-klotho所介導(dǎo)，故FGF21存在下調(diào)apo(a)表達(dá)的分子作用潛質(zhì)。因此，本研究擬探討FGF21對HepG2細(xì)胞apo(a)表達(dá)的影響，并研究其作用機(jī)制，為研究下調(diào)血漿脂蛋白(a)的藥物提供新的干預(yù)靶點(diǎn)。
　　第一部分：FGF21對HepG2細(xì)胞apo(a)表達(dá)的影響
　　目的：觀察FGF21對HepG2細(xì)胞apo(a)表達(dá)

4、的影響
　　實(shí)驗(yàn)方法： HepG2細(xì)胞用高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，待生長融合后，換新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)6h使細(xì)胞同步化生長，后再加入含不同濃度的FGF21（0ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、400ng/ml）培養(yǎng)基培養(yǎng)24h；及用200ng/ml FGF21處理不同時(shí)間（0、6h、12h、24h、48h）；Real Time-PCR的方法觀察apo(a)mRNA表達(dá)，用Western blot、細(xì)胞免疫組化觀察ap

5、o(a)蛋白表達(dá)變化，用ELISA法檢測培養(yǎng)基中apo(a)分泌水平。
　　結(jié)果：與0ng/ml組相比，隨著FGF21濃度的增加， HepG2細(xì)胞內(nèi)的apo(a)表達(dá)及apo(a)分泌呈濃度依賴性下調(diào)，其中以200ng/ml、400ng/ml降低最為明顯；與0h組相比，隨著FGF21作用時(shí)間的延長，HepG2細(xì)胞內(nèi)的apo(a)表達(dá)及apo(a)分泌呈時(shí)間依賴性的下調(diào)，其中以24h下調(diào)作用最為顯著。
　　小結(jié)：FGF21呈濃

6、度及時(shí)間依賴性下調(diào)HepG2細(xì)胞apo(a)的表達(dá)及分泌水平。
　　第二部分：FGF21影響HepG2細(xì)胞apo(a)表達(dá)的機(jī)制研究
　　目的：探討FGF21調(diào)控HepG2細(xì)胞apo(a)表達(dá)的分子機(jī)制
　　試驗(yàn)方法：培養(yǎng)HepG2細(xì)胞，分別用ERK1/2信號的抑制劑PD98059或FGFR1抑制劑PD166866， Elk-1siRNA對細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，隨后加入200ng/ml FGF21處理細(xì)胞24h。以Weste

7、rn blot方法檢測細(xì)胞中ERK1/2、p-ERK1/2、Elk1、p-ERK1/2、FGFR1-4、HNF4α、FXR及apo(a)表達(dá)，同時(shí)運(yùn)用Real Time-PCR檢測細(xì)胞中apo(a)、FGFR1-4mRNA表達(dá)變化，ELISA法檢測培養(yǎng)基中的apo(a)分泌水平變化。
　　結(jié)果：FGF21可以明顯的上調(diào) p-ERK1/2表達(dá)，抑制 ERK1/2激活可以反轉(zhuǎn) FGF21對HepG2細(xì)胞apo(a)表達(dá)的抑制作用；干擾

8、Elk1及抑制FGFR1也可起到相同的效果。而抑制FGFR1可減弱FGF21對ERK1/2、Elk1激活。此外，F(xiàn)GF21還可抑制HNF4α的表達(dá)，但對FXR無影響，而抑制FGFR1及ERK1/2激活均可逆轉(zhuǎn)FGF21下調(diào)HNF4α表達(dá)。
　　小結(jié)：FGF21通過 FGFR1-ERK1/2-Elk1通路及 FGFR1-ERK1/2-HNF4α途徑協(xié)同下調(diào)HepG2細(xì)胞apo(a)表達(dá)。
　　結(jié)論：
　　1. FGF21