YMO1通過RhoC信號通路抑制肝細(xì)胞癌侵襲轉(zhuǎn)移的研究.pdf

1、原發(fā)性肝細(xì)胞癌(HCC)是一種臨床最為常見的惡性腫瘤。隨著肝臟外科技術(shù)的發(fā)展，肝癌的手術(shù)切除率不斷提高，但其術(shù)后轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)率仍居高不下，導(dǎo)致其整體療效仍無顯著改善。因此，肝癌術(shù)后的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)已成為嚴(yán)重制約提高肝癌長期生存率的主要障礙。深入研究肝癌高侵襲轉(zhuǎn)移，有助于弄清肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的的分子機(jī)制。探索有效的預(yù)防和治療復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的手段是肝癌研究領(lǐng)域中的重要科學(xué)問題，對于進(jìn)一步提高肝癌患者術(shù)后整體治療水平具有重要意義。
　　嵌合體眼狀蛋白1（Y

2、MO1），又名EPB41 L5，是新近發(fā)現(xiàn)的與胚胎原腸胚發(fā)育的蛋白，廣泛表達(dá)于哺乳動(dòng)物胚胎中、內(nèi)胚層上皮組織。鑒于其具有調(diào)節(jié)細(xì)胞肌動(dòng)蛋白骨架，調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附分子，基底膜形成及細(xì)胞極性等功能，且在胚胎中的定位與成體肝臟一致，提示YMO1可能參與了肝癌侵襲轉(zhuǎn)移過程。因此，本課題在研究YMO1在肝癌組織樣本及肝癌細(xì)胞系中表達(dá)情況的基礎(chǔ)上，結(jié)合臨床隨訪病例分析YMO1與預(yù)后的關(guān)系，并通過構(gòu)建YMO1過表達(dá)質(zhì)粒，在細(xì)胞系中上調(diào)YMO1的表達(dá)，綜合運(yùn)

3、用一系列功能學(xué)方法從體外和體內(nèi)兩個(gè)層面研究了YMO1調(diào)控HCC侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，同時(shí)探討YMO1抑制HCC侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。研究結(jié)果顯示:
　　1、YMO1 mRNA和蛋白在HCC組織中均呈低表達(dá):首先在前期的預(yù)實(shí)驗(yàn)中，采用實(shí)時(shí)定量PCR對30例肝癌組織及相應(yīng)癌旁組織對4.1蛋白家族的7個(gè)成員4.1R(EPB41)、4.1N(EPB41L1)、4.1G(EPB41L2)、4.1B(EPB41L3)、NBL4(EPB41L4A)

4、、EHM2(EPB41L4B)、YMO1(EPB41L5)的mRNA的表達(dá)水平進(jìn)行定量檢測。結(jié)果顯示YMO1在肝癌組織中的表達(dá)下調(diào)。采用RT-PCR、Realtime PCR和Westem blot等方法檢測了30例新鮮肝癌組織及相應(yīng)的鄰近非癌肝組織以及6例正常肝組織中YMO1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)YMO1 mRNA和蛋白在肝癌組織中表達(dá)明顯低于鄰近非癌肝組織。孤立性大肝癌(SLHCC)和小肝癌(SHCC)中的YMO1 m

5、RNA和蛋白表達(dá)水平明顯高于結(jié)節(jié)性肝癌(NHCC)。繼之又采用RT-PCR及Western blot檢測正常肝細(xì)胞LO2細(xì)胞系及HepG2、MHCC97-L、MHCC97-H和HCCLM3四種侵襲轉(zhuǎn)移潛能依次升高的肝癌細(xì)胞系中的YMO1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果顯示YMO1 mRNA和蛋白在L02細(xì)胞系中顯著高于其他肝癌細(xì)胞系;且其表達(dá)水平在HepG2、MHCC97-L、MHCC97-H和HCCLM3細(xì)胞中依次降低，提示YMO1的

6、低表達(dá)與肝癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移潛能密切相關(guān)。
　　2、YMO1低表達(dá)與肝癌臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系:采用免疫組化法檢測155例HCC組織中YMO1的表達(dá)，結(jié)果顯示YMO1主要分布于胞漿內(nèi)及胞膜，肝癌組織中YMO1蛋白陽性表達(dá)率(63/155，40.6％)明顯低于鄰近非癌肝組織(131/155，84.5％)，且其表達(dá)水平與肝癌結(jié)節(jié)個(gè)數(shù)、有無包膜及有無靜脈浸潤等臨床病理特征相關(guān)。同時(shí)，YMO1低表達(dá)組的無瘤生存時(shí)間及總體生存時(shí)間均明顯短于

7、YMO1高表達(dá)組。多因素分析顯示YMO1低表達(dá)與結(jié)節(jié)數(shù)目和靜脈浸潤是預(yù)測肝癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示YMO1的低表達(dá)預(yù)示肝癌患者不良預(yù)后。
　　3、YMO1在體外能顯著抑制肝癌細(xì)胞的遷移運(yùn)動(dòng)能力而不影響肝癌細(xì)胞的增殖:構(gòu)建了pcDNA3-YMO1過表達(dá)質(zhì)粒，使用Lipofactamine LTX轉(zhuǎn)染HCCLM3細(xì)胞系。經(jīng)過G418篩選獲得了穩(wěn)定表達(dá)YMO1細(xì)胞系HCCLM3YMO1+和空質(zhì)粒對照組HCCLM3vector細(xì)胞，并采

8、用RT-PCR和Western blot方法驗(yàn)證YMO1的表達(dá)效率。劃痕愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示 HCCLM3YMO1+遷移運(yùn)動(dòng)能力較HCCLM3vector細(xì)胞明顯減弱;Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步顯示HCCLM3YMO1+細(xì)胞侵襲能力較HCCLM3vector細(xì)胞的明顯下降;HCCLM3YMO1+細(xì)胞的同質(zhì)性粘附能力較HCCLM3vector細(xì)胞明顯增強(qiáng)而異質(zhì)性粘附能力明顯減弱。而細(xì)胞生長曲線結(jié)果則顯示HCCLM3YMO1+與HCCLM

9、3vector細(xì)胞的增殖能力無明顯區(qū)別，表明上調(diào)YMO1的表達(dá)可顯著抑制肝癌細(xì)胞的侵襲運(yùn)動(dòng)能力而對其增殖能力并無影響。
　　4、YMO1能抑制肝癌的體內(nèi)成瘤能力并降低肝內(nèi)與肺轉(zhuǎn)移率:建立了人肝癌細(xì)胞裸鼠皮下成瘤模型及人肝癌細(xì)胞裸鼠肝臟原位種植瘤模型，旨在體內(nèi)進(jìn)一步驗(yàn)證YMO1的功能。結(jié)果顯示，HCCLM3YMO1+組皮下種植瘤成瘤率和腫瘤大小均小于HCCLM3vector組;原位肝臟種植瘤的平均直徑HCCLM3YMO1+組明顯小于

10、HCCLM3vector組，且其肝內(nèi)轉(zhuǎn)移率和肺轉(zhuǎn)移率明顯降低，由此清楚地表明上調(diào)YMO1后不但在體內(nèi)能夠明顯抑制肝癌細(xì)胞的成瘤能力，而且其侵襲轉(zhuǎn)移能力也受到明顯抑制。
　　5、YMO1通過下調(diào)RhoC抑制肝癌侵襲轉(zhuǎn)移:已有研究顯示YMO1蛋白含有一個(gè)可以調(diào)控G蛋白磷酸化過程的PDZ結(jié)構(gòu)域。鑒于RhoGTP酶家族蛋白是通過參與G蛋白磷酸化來影響細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)，選取了一系列經(jīng)典的RhoGTP酶分子進(jìn)行免疫共沉淀篩選。結(jié)果顯示，在選取的一

11、系列RhoGTP酶分子中，HCCLM3YMO1+細(xì)胞中的RhoC和YMO1蛋白有共沉淀，提示YMO1與RhoC存在直接的相互作用。接著在過表達(dá)YMO1的HCCLM3YMO1+細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-RhoC過表達(dá)質(zhì)粒，以HCCLM3YMO1+和HCCLM3vector作為對照，采用Westem blot檢測了RhoC蛋白的表達(dá)水平，pulldown實(shí)驗(yàn)檢測RhoC的GTP酶活性，劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測遷移運(yùn)動(dòng)能力，Transwell實(shí)驗(yàn)

12、檢測侵襲能力，免疫熒光檢測細(xì)胞骨架。結(jié)果顯示，HCCLM3細(xì)胞系在轉(zhuǎn)染pcDNA3-YMO1后，RhoC蛋白表達(dá)水平及GTP酶活性明顯下降，侵襲及運(yùn)動(dòng)遷移能力減弱，細(xì)胞骨架趨于規(guī)整。而共轉(zhuǎn)染pcDNA3-YMO1與pEGFP-C1-RhoC過表達(dá)質(zhì)粒組與HCCLM3vector細(xì)胞系組無區(qū)別。結(jié)果明顯提示，YMO1是通過抑制調(diào)控RhoC活性來抑制肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移。用Western blot檢測ROCK1、PTEN、AKT、FAK、、 ER

13、K1/2的蛋白表達(dá)和蛋白磷酸化水平，結(jié)果顯示，HCCLM3YMO1+細(xì)胞中，ROCK1的表達(dá)以及p-PTEN、p-AKT、p-FAK和p-ERK磷酸化水平明顯下調(diào)，PTEN、AKT、FAK、ERK1/2的蛋白表達(dá)在HCCLM3vector細(xì)胞系、HCCLM3YMO1+細(xì)胞系以及HCCLM3YMO1+RhoC三組細(xì)胞系中均無明顯差別。
　　6．YMO1在肝癌中的表達(dá)受轉(zhuǎn)錄因子PAX5調(diào)控:利用SABiosciences的DECODE

14、轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫對YMO1的啟動(dòng)子序列進(jìn)行分析，推測PAX5可能是調(diào)控YMO1表達(dá)的上游轉(zhuǎn)錄因子。通過雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)、染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)(ChIP)以及Western blot等方法進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果證實(shí)，轉(zhuǎn)錄因子PAX5可以與YMO1的啟動(dòng)子序列的直接結(jié)合，并且PAX5對于YMO1的表達(dá)有上調(diào)作用。進(jìn)一步通過對155例免疫組化的分析，證明在肝癌組織中YMO1與PAX5均呈低表達(dá)，且二者的表達(dá)水平呈正相關(guān);而YMO1在肝癌組織中呈低