二甲雙胍通過AKT信號通路抑制食管鱗癌細胞的侵襲轉移.pdf

1、背景及目的：
　　二甲雙胍是臨床上廣泛應用于治療2型糖尿病的口服降糖藥。近年來大量流行病學研究證實，二甲雙胍可減少2型糖尿病患者的患癌風險。通過深究其作用機制，在體外實驗中發(fā)現(xiàn)二甲雙胍不僅可通過抑制多種惡性腫瘤細胞的增殖、誘導細胞凋亡來發(fā)揮其抗腫瘤效應，同時也可抑制它們的侵襲與轉移。本課題組前期實驗和不少外文文獻證實二甲雙胍可在體內(nèi)外誘導食管癌細胞增殖抑制和促進細胞凋亡；同時也發(fā)現(xiàn)二甲雙胍對多種腫瘤細胞存在抗侵襲、轉移的作用。但腫

2、瘤侵襲轉移所涉及的分子機制是極其復雜的，其中關于二甲雙胍對抑制食管癌侵襲轉移的作用機制研究甚少，結合目前對二甲雙胍抗腫瘤機制的研究背景，為進一步研究二甲雙胍抑制食管鱗癌細胞侵襲轉移的分子機制，本研究將探討二甲雙胍是否可通過AKT依賴的信號通路，調(diào)控NF-κB和侵襲轉移相關蛋白MMP-9、N-cadherin和E-cadherin的表達情況，從而抑制食管癌細胞的侵襲轉移，為臨床上二甲雙胍成為治療食管癌的新型抗腫瘤藥物提供新的理論基礎。

3、r>　　材料和方法：
　　1.用含10％胎牛血清，100U/ml青霉素和100U/ml鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)人食管鱗癌細胞株EC109。
　　2.細胞接種密度為1×106個/6cm培養(yǎng)皿中，至培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜后，用含0 mM、5 mM、10 mM、20 mM的二甲雙胍濃度的培養(yǎng)基處理EC109細胞24h，以無菌超純水處理細胞作為對照組，用transwell和BD Matrigel Invasion Chamber小室

4、分別檢測二甲雙胍處理對EC109細胞的遷移、侵襲的影響。
　　3.細胞接種密度為1×106個/6cm培養(yǎng)皿中，至培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜后，用含0 mM、5 mM、10 mM、20 mM的二甲雙胍濃度的培養(yǎng)基處理EC109細胞24h，以無菌超純水處理細胞作為對照組，用western blot檢測細胞總蛋白的p-AKT、AKT、基質(zhì)金屬蛋白MMP-9、N-cadherin and E-cadherin，和核蛋白NF-κB的表達情況。

5、　　4.細胞接種密度為1×106個/6cm培養(yǎng)皿中，至培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜后，用含20 mM濃度二甲雙胍的培養(yǎng)基處理EC109細胞24h后，加或不加入終濃度為100 nM的胰島素（AKT激活劑）處理20min。另外設置含終濃度為10μM的LY294002（PI3K抑制劑）實驗組，含終濃度為100nM的胰島素實驗組，分別處理EC109細胞24h和20min，以無菌超純水處理細胞為對照組，以DMSO處理細胞為溶劑組，用transwell和BD

6、Matrigel Invasion Chamber小室分別檢測二甲雙胍、LY294002、胰島素等對EC109細胞的遷移、侵襲的影響。
　　5.細胞接種密度為1×106個/6cm培養(yǎng)皿中，至培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜后，用含20mM濃度二甲雙胍的培養(yǎng)基處理EC109細胞24h后，加或不加入終濃度為100nM的胰島素（AKT激活劑）處理20min。另外設置含終濃度為10μM的LY294002（PI3K/AKT抑制劑）實驗組，含終濃度為100n

7、M的胰島素實驗組，分別處理EC109細胞24h和20min，以無菌超純水處理細胞為對照組，以DMSO處理細胞為溶劑組，用western blot檢測細胞總蛋白的p-AKT、AKT、MMP-9、N-cadherin、E-cadherin，和核蛋白NF-κB的表達情況。
　　6.實驗數(shù)據(jù)分析和處理：用Graph Pad Prism5.0軟件，所有數(shù)據(jù)均使用單因素方差分析的Tukey’s檢驗進行統(tǒng)計學分析，每組進行3次重復實驗。 P<0

8、.05和P<0.01有統(tǒng)計學意義。
　　結果：
　　1.二甲雙胍可抑制EC109細胞的遷移和轉移能力。
　　2.二甲雙胍可抑制EC109細胞的AKT的磷酸化。
　　3.二甲雙胍可抑制EC109細胞的NF-κB， MMP-9、N-cadherin的蛋白表達，促進E-cadherin的表達。
　　4.胰島素（AKT激活劑）減弱了二甲雙胍抗EC109細胞遷移、侵襲的能力。
　　5.胰島素減弱了二甲雙胍對食管