二甲雙胍通過Shh信號通路對乳腺癌抗腫瘤作用的機制研究.pdf

1、目的：二甲雙胍是目前臨床應(yīng)用最為廣泛的口服降糖藥物，主要用于治療2型糖尿病。近年來一些臨床流行病學(xué)研究證實二甲雙胍可以降低2型糖尿病患者一些惡性腫瘤的發(fā)病風(fēng)險，多項體外研究和動物實驗發(fā)現(xiàn)二甲雙胍對多種類型的癌細胞均具有一定程度的抑制作用，并可抑制裸鼠移植瘤模型中腫瘤的生長。但是二甲雙胍抑制腫瘤的確切機制至今仍不清楚。本研究主要探討二甲雙胍對乳腺癌細胞Shh信號通路的調(diào)控作用，闡明二甲雙胍通過Shh信號通路對乳腺癌增殖、遷移、侵襲能力及乳

2、腺癌干細胞(BCSCs)干性的影響;并進一步探討腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)在其中的調(diào)控作用。
　　方法：逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和western blot檢測二甲雙胍對乳腺癌MDA-MB-231、MCF-7和BT549細胞中Shh、Smo、Ptc和Gli1表達的影響;將MDA-MB-231細胞分為空白對照組、1μg/mL rhShh蛋白組、3mM二甲雙胍組和1μg/mL rhShh蛋白+3mM二甲雙胍組，用細胞增殖實

3、驗、克隆形成實驗檢測對乳腺癌細胞增殖能力的影響;劃痕實驗、matrigel侵襲實驗檢測對乳腺癌細胞遷移和侵襲能力的影響;流式細胞術(shù)、mammosphere形成實驗檢測對BCSCs干性的改變;將表達綠色熒光蛋白(GFP)的MDA-MB-231細胞接種于BALB/c-nu鼠的乳腺脂肪墊部位，分別給予瘤內(nèi)注射rhShh蛋白、二甲雙胍灌胃、瘤內(nèi)注射rhShh蛋白十二甲雙胍灌胃的處理，使用活體成像系統(tǒng)(IVST)檢測腫瘤體積的大小，比較不同處理組

4、之間腫瘤的生長情況;MDA-MB-231細胞分別轉(zhuǎn)染空白對照質(zhì)粒(siCtr)和AMPK小干擾RNA質(zhì)粒(siAMPK＃2)后，再分別給予rhShh蛋白、二甲雙胍、rhShh蛋白十二甲雙胍的處理，用western blot檢測細胞中Gli1的表達情況，用mammosphere形成實驗和流式細胞術(shù)檢測對BCSCs的影響。
　　結(jié)果：⑴二甲雙胍抑制乳腺癌細胞中Shh、Smo、Ptc和Gli1的表達，且呈現(xiàn)時間依賴性和濃度依賴性。⑵二甲

5、雙胍抑制rhShh蛋白誘導(dǎo)的乳腺癌MDA-MB-231和MCF-7細胞的增殖。用MTT實驗和克隆形成實驗檢測rhShh蛋白、二甲雙胍以及rhShh蛋白和二甲雙胍的聯(lián)合處理對乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231細胞增殖能力的影響。MTT實驗顯示rhShh蛋白促進細胞增殖;二甲雙胍顯著抑制細胞的生長，同時二甲雙胍抑制rhShh蛋白誘導(dǎo)的細胞增殖（**或＃＃P＜0.01）?？寺⌒纬蓪嶒灲Y(jié)果顯示同空白對照組相比，二甲雙胍抑制乳腺癌細胞形成的克

6、隆的數(shù)目和大小，此外，二甲雙胍也抑制了rhShh蛋白誘導(dǎo)的克隆的數(shù)目和大?。?*或＃＃P＜0.01）。⑶裸鼠移植瘤模型中二甲雙胍抑制rhShh蛋白誘導(dǎo)的腫瘤生長。分析熒光數(shù)據(jù)表明rhShh蛋白處理組的腫瘤體積顯著大于空白對照組腫瘤的體積;二甲雙胍抑制了rhShh蛋白誘導(dǎo)的腫瘤生長（**或＃＃P＜0.01）。免疫組化實驗結(jié)果顯示rhShh蛋白組的Gli1表達水平較高，聯(lián)合處理組的Gli1水平比rhShh蛋白組的低。⑷二甲雙胍抑制rhShh

7、蛋白誘導(dǎo)的乳腺癌MDA-MB-231細胞的遷移和侵襲。劃痕實驗顯示rhShh蛋白處理組的MDA-MB-231細胞遷移能力增強;與之相反的是，二甲雙胍抑制MDA-MB-231細胞的遷移能力;聯(lián)合處理組顯示二甲雙胍抑制rhShh蛋白誘導(dǎo)的MDA-MB-231細胞的遷移能力（**或＃＃P＜0.01）。Matrigel侵襲實驗顯示rhShh蛋白處理的細胞穿過matrigel膠和小室膜的數(shù)量約是空白對照組的三倍;同rhShh蛋白處理組相比，rhS

8、hh蛋白聯(lián)合二甲雙胍的處理顯著抑制了細胞的侵襲能力（**或＃＃P＜0.01）。⑸二甲雙胍抑制rhShh蛋白誘導(dǎo)的BCSCs干性增強。Mammosphere形成實驗表明同空白對照組相比，rhShh蛋白作用的MDA-MB-231細胞形成的球體數(shù)目更多、體積更大;而二甲雙胍抑制了MDA-MB-231細胞形成的球體的數(shù)目和體積，也抑制了rhShh蛋白誘導(dǎo)形成數(shù)目更多和體積更大的球體（**或＃＃P＜0.01）。使用流式細胞術(shù)檢測乳腺癌細胞中CD4

9、4+/CD24-/low細胞的比例，rhShh蛋白誘導(dǎo)MDA-MB-231細胞中CD44+/CD24-/low細胞的比例提高;二甲雙胍的作用降低細胞中的CD44+/CD24-/low細胞比例;聯(lián)合處理組顯示二甲雙胍顯著抑制了由rhShh蛋白誘導(dǎo)的CD44+/CD24-/low細胞比例的提高（**或＃＃P＜0.01）。⑹Westernblot顯示同空白對照及轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA后，又進行rhShh蛋白和二甲雙胍聯(lián)合處理的MDA-MB-2

10、31細胞中Gli1的表達水平相比，轉(zhuǎn)染AMPKα1 siRNA＃2后又進行rhShh蛋白和二甲雙胍聯(lián)合處理的MDA-MB-231細胞中Gli1的表達水平明顯升高。⑺在rhShh蛋白和二甲雙胍聯(lián)合處理的情況下，同空白對照及轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA的MDA-MB-231細胞形成的微球體相比，轉(zhuǎn)染AMPKα1 siRNA＃2的MDA-MB-231細胞產(chǎn)生的微球體數(shù)目更多、體積更大（&&P＜0.01），而且其中的CD44+/CD24-/low干細