SIPA1通過下調Rap1-ERK通路抑制HCC的復發(fā)轉移.pdf

1、一肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是當前嚴重威脅我國人民生命健康的最主要惡性腫瘤之一。隨著肝臟外科技術以及麻醉與圍手術期處理水平的進步，肝癌的手術切除率顯著提高，在一些大的肝臟外科中心肝癌手術死亡率已接近為零。盡管如此，以5年生存率為標志的肝癌整體治療水平仍無顯著改善，究其原因在于肝癌術后的復發(fā)轉移率居高不下。據(jù)統(tǒng)計，肝癌切除術后5年的復發(fā)率高于60％，小肝癌也在40％以上。顯然，肝癌的復發(fā)、轉移已成

2、為嚴重制約肝癌患者長期存活的關鍵因素。因此，深入研究肝癌復發(fā)轉移機制，積極探索有效的抗復發(fā)治療措施是當前肝癌診治中的重點和難點，對于進一步改善肝癌患者長期存活率具有重要意義。
　　 已有的研究證實，SIPA1(Signal-induced Proliferation-associated Gene1，信號誘導的增殖相關基因1)在血液系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了非常重要的作用。新近的研究表明小鼠sipal是決定小鼠乳腺癌轉移傾向

3、的重要基因。眾所周知，肝臟是胚胎時期的重要造血器官，血細胞(如血小板)與腫瘤的轉移密切相關。根據(jù)以上的研究結果我們推測SIPA1基因很可能在HCC復發(fā)轉移中發(fā)揮重要作用。因此，本課題在研究SIPA1在臨床肝癌病例及肝癌細胞系中表達情況的基礎上，進一步通過質粒構建轉染技術上調SIPA1的表達，并綜合利用一系列體外、體內方法研究SIPA1調控HCC侵襲轉移的分子機制。我們獲得了如下研究結果：
　　 1.我們首先采用RT-PCR和We

4、stern blot等方法檢測了SIPA1 mRNA和蛋白在30例新鮮HCC組織及相應鄰近非癌肝組織(ANLT)中的表達水平，結果發(fā)現(xiàn)與ANLT比較，SIPA1 mRNA和蛋白水平在癌組織中表達均顯著下調(P<0.05)，且肝癌組織中SIPA1 mRNA和蛋白表達水平呈明顯正相關(r=0.757，p<0.001)。進一步采用實時定量PCR檢測顯示ANLT中SIPA1 mRNA表達量為癌組織的4.17倍。進而，我們采用免疫組化技術檢測了1

5、30例HCC組織中SIPA1的表達，結果顯示SIPA1主要分布于細胞漿內，其在癌組織的陽性表達率為62.3％(81/130)。肝癌組織中SIPA1低表達與腫瘤多結節(jié)，分化差及靜脈侵襲密切相關(p<0.05)。SIPA1陰性表達組HCC患者的總體生存時間顯著短于SIPA1陽性表達組的患者(41.0±6.6個月vs.66.0±5.2個月，P=0.003)，SIPA1陰性表達組的無瘤生存時間亦顯著短于SIPA1陽性表達組(35.0±6.1個月

6、vs.61.1±5.4個月，P=0.002)。多元Cox回歸模型顯示SIPA1陰性表達是HCC預后的獨立危險因素。
　　 2.RT-PCR及Western blot方法檢測SIPA1 mRNA和蛋白在HepG2、MHCC97-L和HCCLM3這3種侵襲轉移潛能依次升高的肝癌細胞系中的表達水平，并以正常肝細胞系L02、常氏肝細胞系CCL13作為對照。結果顯示SIPA1mRNA和蛋白在HepG2、HCCLM3和MHCC97-L肝癌細

7、胞系中的表達水平顯著低于CCL13和L02正常肝細胞系(P<0.05)，且其表達水平在HepG2、MHCC97-L、HCCLM3細胞中依次降低(P<0.05)，提示SIPA1表達水平與肝癌細胞的侵襲轉移潛能呈負相關。同時確定以SIPA1表達水平最低的HCCLM3為過表達質粒的靶細胞。
　　 3.我們構建了重組質粒pcDNA3.1-SIPA1，使用Lipofectamine2000轉染并行G418篩選，經RT-PCR和Wester

8、n blot等方法驗證SIPA1的表達，最終獲得了穩(wěn)定轉染細胞系HCCLM3SIPA1+和空質粒對照組HCCLM3vector細胞。采用MTT法、粘附實驗、劃痕愈合實驗和Transwell等實驗方法分別檢測兩組細胞在細胞增殖與粘附能力、遷移運動能力和侵襲能力上的差別。MTT研究結果顯示，HCCLM3SIPA1+的細胞增殖能力較HCCLM3vector顯著下降(P<0.05)；粘附實驗結果顯示與HCCLM3vector細胞相比，HCCLM

9、3SIPA1+細胞與FN的粘附能力明顯減弱(P<0.05)；劃痕愈合實驗和Transwell侵襲實驗顯示HCCLM3SIPA1+與HCCM3vector相比，細胞的遷移運動能力和侵襲能力均顯著下降(P<0.05)。以上體外實驗研究結果證實上調SIPA1的表達可顯著抑制HCC細胞的增殖、粘附、遷移和侵襲能力。進一步采用免疫熒光技術檢測HCCLM3SIPA1+細胞和HCCLM3vector細胞的骨架蛋白F-actin的形成情況，發(fā)現(xiàn)SIPA

10、1能明顯減少F-actin的形成。
　　 4.為進一步體內觀察上調SIPA1對肝癌侵襲轉移的影響，我們建立了裸鼠原位肝癌肺轉移模型。結果顯示，HCCLM3SIPA1+細胞在肝臟中成瘤體積明顯較HCCLM3vector細胞小，分別為1.57±0.08cm3和6.28±0.13cm3，(P<0.05)。通過裸鼠肺組織連續(xù)切片觀察肺轉移灶的發(fā)生率，發(fā)現(xiàn)與HCCLM3vector組相比，HCCLM3SIA1組的肺轉移率顯著下降(16.7

11、％vs.83.3％，P=0.021)。由此證明，上調SIPA1可顯著抑制肝癌細胞的體內成瘤能力和侵襲轉移能力。
　　 5.綜合已有的研究，我們推測SIPA1可能通過Rap1-ERK信號傳導通路調控肝癌細胞的侵襲轉移。為證實上述假說，我們首先檢測了HCCLM3SIPA1+細胞和HCCLM3Vector細胞中Rap1的活性，研究發(fā)現(xiàn)與后者相比，過表達SIPA1的HCCLM3SIPA1+細胞中，Rap1的活性顯著降低(P<0.05)；

12、免疫共沉淀技術亦證實HCCLM3SIPA1+細胞中SIPA1與Rap1存在直接的相互作用。進而，我們采用Rap1激活因子8CPT-2Me-cAMP(終濃度100μM)，恢復HCCLM3SIPA1+細胞中Rap1的活性，反向驗證Rap1在SIPA1調控肝癌侵襲轉移中的作用。結果發(fā)現(xiàn)，恢復Rap1的活性后，細胞的遷移運動能力和和侵襲能力得到顯著恢復(P<0.05)且細胞骨架蛋白F-actin表達亦得到明顯恢復。Western blot證實H

13、CCLM3SIPA1+細胞中Rap1下游基因ERK的磷酸化水平顯著下降(P<0.05)，恢復Rap1活性后p-ERK的表達得到恢復。上述研究結果證實，SIPA1可通過下調Rap1-ERK信號傳導通路抑制肝癌細胞的侵襲轉移。
　　 綜上所述，我們首次發(fā)現(xiàn)SIPA1在肝細胞癌組織中的表達顯著下調，其表達水平與肝癌分化差、多結節(jié)、靜脈侵犯等臨床病理特征密切相關，同時與肝細胞癌預后差和術后早期發(fā)生復發(fā)轉移等密切相關。SIPA1是肝細胞癌