過(guò)表達(dá)Ack1通過(guò)Crk信號(hào)通路促進(jìn)肝細(xì)胞癌侵襲轉(zhuǎn)移.pdf

1、肝細(xì)胞癌(HCC)是全球最為常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，2002年全球HCC新發(fā)病例數(shù)為62.6萬(wàn)，而年死亡人數(shù)達(dá)59.8萬(wàn)，死亡人數(shù)與發(fā)病人數(shù)比接近1∶1，預(yù)后相當(dāng)惡劣。中國(guó)每年HCC死亡病例數(shù)占全球總數(shù)的55％，HCC死亡率己達(dá)20.37/10萬(wàn)，居國(guó)內(nèi)惡性腫瘤死亡率第二位。綜合分析究其原因，其中HCC的高侵襲轉(zhuǎn)移能力是導(dǎo)致其不良預(yù)后的關(guān)鍵原因之一。深入探討HCC侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，闡明在侵襲轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用的基因，有助于發(fā)現(xiàn)新的HCC預(yù)后

2、標(biāo)志物和研制新的有效的抗HCC藥物。我們?cè)谙惹暗呐R床實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)孤立性大肝癌(SLHCC)較結(jié)節(jié)性肝癌(NHCC)有著明顯較低的侵襲轉(zhuǎn)移潛能和較好的預(yù)后。在這個(gè)非常有意義的臨床發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上，我們以SLHCC為切入點(diǎn)對(duì)HCC侵襲轉(zhuǎn)移潛能的內(nèi)在分子機(jī)制進(jìn)行了一系列研究。我們采用了基因芯片的技術(shù)分析了在SLHCC和NHCC存在顯著差異表達(dá)的基因，發(fā)現(xiàn)Ack1(Activated Cdc42-associated tyrosine kinase1

3、)在NHCC中的表達(dá)水平較SLHCC顯著升高，提示其可能為一個(gè)與HCC侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因。
　　 Ack1基因定位于人染色體3q29，其編碼蛋白大小約120KD，主要定位于細(xì)胞胞漿，其分子結(jié)構(gòu)包括一個(gè)激酶區(qū)、一個(gè)SH3區(qū)、一個(gè)Cdc42/Rac結(jié)合區(qū)和一個(gè)富含脯氨酸的羧基端。Ack1蛋白屬于酪氨酸激酶家族，最早作為Cdc42下游的作用蛋白被發(fā)現(xiàn)。已有的研究表明，Ack1作為Cdc42下游的效應(yīng)器參與了多條信號(hào)通路，在細(xì)胞增殖、運(yùn)

4、動(dòng)和侵襲中發(fā)揮重要作用。盡管如此，Ack1在惡性腫瘤中作用還遠(yuǎn)未闡明，其與腫瘤患者的預(yù)后關(guān)系及腫瘤的臨床病理特征的關(guān)系尚不清楚，且其在HCC中的作用尚未有研究涉及?；诖?，我們?cè)诒狙芯恐型ㄟ^(guò)體內(nèi)和體外兩個(gè)水平，運(yùn)用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、小RNA干擾和裸鼠成瘤等實(shí)驗(yàn)方法，對(duì)Ack1在HCC侵襲轉(zhuǎn)移中的作用，以及其可能的分子機(jī)制進(jìn)行了一系列研究，主要結(jié)果如下：
　　 1.我們運(yùn)用real-time RT-PCR及Western blot方法在檢

5、測(cè)了38例手術(shù)切除的新鮮HCC和相應(yīng)的鄰近非瘤肝組織(ANLT)以及5例正常肝組織(NL)中Ack1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示Ack1 mRNA和蛋白均在HCC中明顯高表達(dá)(P＜0.05)。免疫組化法檢測(cè)了131例HCC石蠟切片中Ack1蛋白的表達(dá)強(qiáng)度。結(jié)果顯示Ack1在85.5％(112/131)的HCC中表達(dá)，根據(jù)免疫組化的結(jié)果將此131例HCC分為Ack1高表達(dá)組和Ack1低表達(dá)組并比較兩組患者的預(yù)后，結(jié)果顯示Ack1高

6、表達(dá)組患者的術(shù)后無(wú)瘤生存率(P＜0.05)和總生存率(P＜0.01)皆明顯短于Ack1低表達(dá)組。進(jìn)一步將Ack1蛋白表達(dá)水平納入單因素和多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析。結(jié)果顯示Ack1的高表達(dá)是HCC患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(RR,1.758;P＝0.029)。繼而我們又進(jìn)一步分析了Ack1表達(dá)水平與HCC不同臨床病理特征之間的關(guān)系，結(jié)果顯示Ack1的表達(dá)水平與腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)目、細(xì)胞分化程度以及有無(wú)靜脈浸潤(rùn)等與HCC侵襲性生長(zhǎng)相關(guān)的臨床病理

7、特征密切相關(guān)(P＜0.05)，并且在NHCC中Ack1的表達(dá)明顯高于SLHCC。提示Ack1的高表達(dá)與HCC的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，并可能因此而導(dǎo)致了HCC患者的不良預(yù)后。
　　 2.RT-PCR及Western blot方法檢測(cè)Ack1 mRNA和蛋白在HepG2、MHCC97-L和HCCLM3這3種侵襲轉(zhuǎn)移潛能依次遞增的HCC細(xì)胞系中的表達(dá)水平，并以常氏肝細(xì)胞系CCL13作為對(duì)照。結(jié)果顯示Ack1 mRNA和蛋白在3種HCC細(xì)胞

8、系中的表達(dá)皆顯著高于CCL13(P＜0.01)，且其表達(dá)水平在HepG2、MHCC97-L和HCCLM3細(xì)胞中依次升高（任意兩者比較，P＜0.05），提示Ack1的高表達(dá)與HCC細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移潛能密切相關(guān)。
　　 3.為了尋找Ack1參與HCC的生長(zhǎng)和侵襲轉(zhuǎn)移的直接證據(jù)，我們接下來(lái)采用體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了驗(yàn)證。我們選取了侵襲轉(zhuǎn)移潛能相對(duì)較低的MHCC97-L細(xì)胞，利用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的方法獲得了過(guò)表達(dá)Ack1的MHCC97-L細(xì)胞系MHCC9

9、7-LAck1，以轉(zhuǎn)染空載體的MHCC97-L細(xì)胞系MHCC97-LVector作為對(duì)照，并建立了MHCC97-L裸鼠原位HCC生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移模型，以此觀察過(guò)表達(dá)Ack1對(duì)HCC生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的作用。結(jié)果顯示MHCC97-LAck1組裸鼠所形成的肝臟原位種植瘤的平均體積較MHCC97-LVector組裸鼠明顯增大(P＜0.05)，且有著更高肝內(nèi)轉(zhuǎn)移率(P＜0.05)和肺轉(zhuǎn)移率(P＜0.01)，提示上調(diào)Ack1的表達(dá)促進(jìn)了HCC在體內(nèi)的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。

10、
　　 4.為進(jìn)一步深入研究Ack1在HCC中的作用，解釋我們?cè)隗w內(nèi)實(shí)驗(yàn)觀察到的Ack1對(duì)HCC生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的作用。我們隨后進(jìn)行了一系列體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)，從細(xì)胞的層面來(lái)觀察上調(diào)Ack1對(duì)HCC細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的作用。生長(zhǎng)曲線和平板克隆形成實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示MHCC97-LAck1細(xì)胞較MHCC97-LVector細(xì)胞的增殖能力顯著增強(qiáng)，生長(zhǎng)速度顯著加快(P＜0.05)；劃痕愈合實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示MHCC97-LAck1細(xì)胞較MHCC97-

11、LVector細(xì)胞遷移能力顯著增強(qiáng)(P＜0.01)；基質(zhì)膠侵襲實(shí)驗(yàn)顯示MHCC97-LAck1細(xì)胞較MHCC97-LVector細(xì)胞的侵襲能力亦顯著增強(qiáng)(P＜0.01)。進(jìn)一步行細(xì)胞骨架(F-actin)熒光染色發(fā)現(xiàn)顯示過(guò)表達(dá)Ack1以后，MHCC97-L細(xì)胞的肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架發(fā)生明顯形變。這些結(jié)果提示上調(diào)Ack1能夠增強(qiáng)HCC細(xì)胞的惡性表型，促進(jìn)HCC細(xì)胞生長(zhǎng)增殖、運(yùn)動(dòng)和侵襲能力，從而促進(jìn)HCC的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。
　　 5.接下來(lái)

12、我們進(jìn)一步研究試圖弄清楚Ack1通過(guò)何種分子機(jī)制促進(jìn)HCC細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。鑒于已有的研究證實(shí)Crk在腫瘤運(yùn)動(dòng)侵襲中發(fā)揮著重要作用，并且Crk參與了Ack1的同源蛋白Ack2誘導(dǎo)的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)。因此我們推測(cè)Crk亦可能參與了Ack1在HCC中的信號(hào)通路。我們首先檢測(cè)了MHCC97-L細(xì)胞中Crk的表達(dá)水平，以常肝細(xì)胞系CCL13作為對(duì)照，結(jié)果顯示Crk在MHCC97-L細(xì)胞中存在明顯的表達(dá)上調(diào)，提示Crk可能在HCC的發(fā)生和/或發(fā)展發(fā)揮

13、了一定的作用。接下來(lái)我們用免疫共沉淀的方法證明了在MHCC97-L中Ack1與Crk存在相互作用。隨后我們利用小RNA干擾的方法阻斷Crk的表達(dá)，再重復(fù)前面所進(jìn)行的一系列體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)，以觀察阻斷Crk對(duì)Ack1誘導(dǎo)的HCC細(xì)胞增殖、運(yùn)動(dòng)、侵襲和轉(zhuǎn)移的影響。體內(nèi)和體外的實(shí)驗(yàn)顯示阻斷Crk對(duì)Ack1誘導(dǎo)增強(qiáng)的HCC生長(zhǎng)和增殖并無(wú)顯著影響(P＞0.05)；而對(duì)Ack1誘導(dǎo)增強(qiáng)的HCC運(yùn)動(dòng)、侵襲和轉(zhuǎn)移能力皆有明顯抑制作用(P＜0.05)，且進(jìn)

14、一步研究發(fā)現(xiàn)在Crk被阻斷的情況下，過(guò)表達(dá)Ack1不能再對(duì)HCC的運(yùn)動(dòng)、侵襲和轉(zhuǎn)移產(chǎn)生顯著的促進(jìn)作用(P＞0.05)，提示Crk參與了Ack1誘導(dǎo)的HCC運(yùn)動(dòng)、侵襲和轉(zhuǎn)移的信號(hào)通路。
　　 通過(guò)以上的研究，我們發(fā)現(xiàn)了Ack1在HCC中表達(dá)上調(diào)并且在HCC的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要作用。我們還首次證實(shí)了Ack1的高表達(dá)與腫瘤患者的不良預(yù)后以及侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的臨床病理特征密切相關(guān)；并且首次證實(shí)了過(guò)表達(dá)Ack1通過(guò)Crk信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)促進(jìn)肝細(xì)