丹酚酸A調(diào)控Nrf2通路對HepG2細(xì)胞氧化損傷保護(hù)機(jī)制的研究.pdf

1、目的:本研究建立HepG2細(xì)胞系的H2O2損傷模型,探討丹酚酸A(Salvianolicacid A,SAA)的細(xì)胞保護(hù)作用與二相解毒酶NQO1、GST、HO-1的誘導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄因子Nrf2激活之間的關(guān)系,闡明丹酚酸A抗氧化損傷的分子機(jī)制。
　　 方法:
　　 1.丹酚酸A對HepG2細(xì)胞二相酶的誘導(dǎo)作用
　　 HepG2細(xì)胞隨機(jī)分成四組:正常對照組;低、中、高劑量丹酚酸A組(0.2μM、2μM、20μM)。藥物與細(xì)

2、胞共同孵育6小時后分別測定以下指標(biāo):采用化學(xué)分光光度法測定還原型谷胱甘肽(Reduced Glutathione,GSH)的含量。采用免疫印跡法(Westem blotting)檢測細(xì)胞內(nèi)醌氧化還原酶(NAD(P)H:quinone oxidoreductase1,NQO1)、血紅素氧合酶-1(Heme Oxygenase-1,HO-1)、谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(Glutathione S-transferase,GST)的蛋白表達(dá)水平。<

3、br>　　 2.丹酚酸A對HepG2細(xì)胞Nrf2通路的激活作用
　　 (1)HepG2細(xì)胞隨機(jī)分成四組:正常對照組;低、中、高劑量丹酚酸A組(0.2μM、2μM、20μM)。藥物與細(xì)胞共同孵育6小時后測定:轉(zhuǎn)錄因子Nrf2(NF-E2-related factor2)及胞漿伴侶分子Keapl(Kelch-like ECH associated proteinl)的蛋白表達(dá);采用半定量RT-PCR(Reverse Transcr

4、iption Polymerase Chmn Reaction)法測定HO-1、Nrf2的mRNA表達(dá)水平。
　　 (2)HepG2細(xì)胞隨機(jī)分為四組:陰性對照組(NC);轉(zhuǎn)染Nrf2 small interferingRNA(siRNA)組;陰性對照+丹酚酸A組(20μM)和轉(zhuǎn)染Nrf2 siRNA+丹酚酸A(20μM)組。轉(zhuǎn)染后,丹酚酸A作用6小時提取細(xì)胞核蛋白,免疫印跡法測定Nrf2蛋白表達(dá)水平。
　　 3.丹酚酸A

5、對H2O2損傷的HepG2細(xì)胞的保護(hù)作用研究
　　 (1)HepG2細(xì)胞隨機(jī)分為五組:正常對照組;H2O2損傷組(終濃度3.5mM);低、中、高濃度丹酚酸A組(0.2μM、2μM、20μM)。給藥2小時后,損傷組和藥物組加入H2O2,繼續(xù)培養(yǎng)4小時后進(jìn)行以下試驗:采用MTT法測定細(xì)胞存活率;采用化學(xué)分光光度法測定細(xì)胞上清液中乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)含量。
　　 (2)HepG2細(xì)胞

6、隨機(jī)分為四組:正常對照組;20μM丹酚酸A組;H2O2損傷組(終濃度3.5mM);20μM丹酚酸A+H2O2組。采用免疫印跡法檢測細(xì)胞內(nèi)NQO1、HO-1、GST及Nrf2的蛋白表達(dá);采用RT-PCR法測定HO-1與Nrf2的mRNA表達(dá)水平。
　　 結(jié)果:1.丹酚酸A與HepG2細(xì)胞共同孵育6小時后,與對照組相比,藥物組GSH活性提高(P＜0.01),在中、高劑量組尤為明顯,呈劑量依賴性。
　　 2.丹酚酸A與HepG

7、2細(xì)胞共同孵育6小時后,與對照組相比,中、高濃度藥物組二相酶NQO1、HO-1、GST蛋白表達(dá)顯著升高(P＜0.01),轉(zhuǎn)錄因子Nrf2蛋白表達(dá)上調(diào)(P＜0.01),并有劑量依賴性;Keap1蛋白表達(dá)則明顯下調(diào)(P＜0.01),與二相酶及Nrf2的蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。提示丹酚酸A對二相酶的上調(diào)是通過激活Nrf2的核易位而實現(xiàn)。
　　 3.Nrf2-624干擾序列轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞48小時后,與對照組相比,明顯抑制Nrf2的蛋白表達(dá)

8、(P＜0.01);給予丹酚酸A后,對照組Nrf2蛋白表達(dá)水平上調(diào)(P＜0.01),而Nrf2 siRNA轉(zhuǎn)染組無明顯變化,表明促進(jìn)Nrf2在正常細(xì)胞內(nèi)表達(dá)是丹酚酸A的作用靶點之一。
　　 4.采用H2O2刺激HepG2細(xì)胞后,與對照組相比,損傷組細(xì)胞存活率顯著下降(P＜0.01),上清液LDH含量明顯增高(P＜0.01),中、高濃度丹酚酸A預(yù)處理組細(xì)胞存活率明顯上升(P＜0.01),低、中、高藥物預(yù)處理組LDH含量顯著增加(P＜

9、0.01),并具有濃度依賴性。顯示丹酚酸A對過氧化氫損傷的HepG2細(xì)胞具有保護(hù)作用。
　　 5.與對照組相比,H2O2刺激HepG2細(xì)胞后,20μM丹酚酸A組與損傷組NQO1、HO-1、GST和Nrf2蛋白表達(dá)明顯上升(P＜0.01),表明藥物與H2O2均可刺激Nrf2核易位。與損傷組相比,20μM丹酚酸A預(yù)處理的H2O2組蛋白表達(dá)為最高(P＜0.01),表明丹酚酸A可在細(xì)胞受損情況下進(jìn)一步促進(jìn)Nrf2核易位和二相解毒酶表達(dá)。