四氯苯醌激活HepG2細(xì)胞Nrf2-ARE信號(hào)通路的機(jī)制分析.pdf

1、四氯苯醌（TCBQ）是工業(yè)除草劑五氯酚的代謝產(chǎn)物，其體內(nèi)外模型已顯示出活性氧機(jī)制誘導(dǎo)的肝毒性和遺傳毒性作用。Nrf2/ARE信號(hào)通路在機(jī)體內(nèi)的抗氧化過(guò)程中發(fā)揮重要作用，它可以有效誘導(dǎo)Ⅱ相解毒酶及抗氧化蛋白的表達(dá)。Keap1和Bach1均是機(jī)體內(nèi)Nrf2/ARE信號(hào)通路的重要轉(zhuǎn)錄抑制因子，在Nrf2通路的激活中發(fā)揮重要作用。該研究的目的是為了分析TCBQ能否激活Nrf2/ARE信號(hào)通路，并探討其具體的激活機(jī)制，可以為T(mén)CBQ誘導(dǎo)毒性干預(yù)的

2、治療提供依據(jù)。
　　第一部分：Nrf2/ARE信號(hào)通路的激活需要Nrf2和Keap1的解離，該部分的研究分析了TCBQ能否激活Nrf2信號(hào)通路，并分析了Keap1在Nrf2信號(hào)通路激活中的重要作用。HepG2細(xì)胞在使用TCBQ給藥后，發(fā)現(xiàn)Nrf2及抗氧化蛋白HO-1、NQO1的表達(dá)上調(diào)，并存時(shí)間和劑量依賴(lài)關(guān)系。免疫熒光實(shí)驗(yàn)同樣證明了 TC BQ作用后Nrf2表達(dá)的上調(diào)。qRT-PCR實(shí)驗(yàn)顯示了Nrf2而非Keap1基因表達(dá)水平的上

3、調(diào)。Western Blot分別檢測(cè)細(xì)胞核、質(zhì)蛋白內(nèi)Nrf2的變化，清晰證明了Nrf2由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移進(jìn)入細(xì)胞核的過(guò)程。雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)顯示了Nrf2入核后，和ARE信號(hào)元件結(jié)合，并誘導(dǎo)抗氧化蛋白的表達(dá)，這可能作為 TCBQ中毒后的抗氧化效應(yīng)。Keap1依賴(lài)的Nrf2通路激活機(jī)制是目前研究的重點(diǎn)。氧化還原型電泳結(jié)果顯示TCBQ促使了Keap1交聯(lián)二聚體的形成，免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)顯示它并沒(méi)有誘導(dǎo)Keap1和Cullin3的解離，泛素化實(shí)驗(yàn)顯示TCB

4、Q誘導(dǎo)了泛素分子由Nrf2向Keap1的轉(zhuǎn)移。Keap1交聯(lián)二聚體的形成及泛素分子的轉(zhuǎn)移均會(huì)引起其構(gòu)象的改變，促使Nrf2從Keap1上釋放并入核，進(jìn)而激活Nrf2/ARE信號(hào)通路。
　　第二部分：和Keap1類(lèi)似，Bach1是Nrf2的另一重要轉(zhuǎn)錄抑制因子，可以與Nrf2競(jìng)爭(zhēng)同ARE抗氧化元件結(jié)合，進(jìn)而調(diào)控抗氧化蛋白的表達(dá)。該部分研究的主要目的是探討B(tài)ach1在TCBQ誘導(dǎo)Nrf2/ARE信號(hào)通路激活中的作用。Western B

5、lot和免疫熒光實(shí)驗(yàn)清晰證明了TCBQ給藥后，Bach1在1h內(nèi)即完成了出核的過(guò)程，并伴隨著Nrf2的逐漸入核。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證明了TCBQ誘導(dǎo)Bach1的出核依賴(lài)于Bach1和Crm1受體結(jié)合以及酪氨酸磷酸化作用。ChIP實(shí)驗(yàn)證明了TCBQ作用于細(xì)胞后，Nrf2和Bach1競(jìng)爭(zhēng)性的與ARE結(jié)合。泛素化實(shí)驗(yàn)顯示了Bach1出核后，在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)經(jīng)泛素化作用而降解。qRT-PCR實(shí)驗(yàn)證明了TCBQ增加了Bach1的轉(zhuǎn)錄水平，通過(guò)加入放線菌酮（