基于Nrf2-ARE信號(hào)通路研究仙鶴草活性組分改善IR的作用機(jī)制.pdf

1、糖尿病屬于內(nèi)分泌失調(diào)的代謝性疾病，主要伴隨著糖耐量低、尿糖陽(yáng)性以及持續(xù)高血糖癥狀等病理特征。目前，糖尿病主要分類為：I型糖尿病和II型糖尿病，其中II型糖尿?。═2DM）患者在所有糖尿病患者中所占比例高達(dá)90%以上，因此T2DM引起了國(guó)內(nèi)外的廣泛關(guān)注。胰島素抵抗(IR)是導(dǎo)致T2DM的主要原因之一，而IR是由氧化應(yīng)激通過多途徑、多靶點(diǎn)作用于胰島素信號(hào)傳導(dǎo)通路所導(dǎo)致。以氧化應(yīng)激信號(hào)通路為靶向途徑，研發(fā)改善IR的藥物對(duì)開發(fā)糖尿病新藥具有重要

2、意義。因此，本文在前期研究發(fā)現(xiàn)仙鶴草中活性組分黃酮（FC）和三萜（TC）具有抗氧化活性的基礎(chǔ)上，將深入探討FC和TC組分通過抗氧化途徑達(dá)到緩解IR效果的具體機(jī)制，明確仙鶴草中的活性組分改善IR所涉及的具體途徑以及信號(hào)通路，為開發(fā)仙鶴草活性組分作為抗糖尿病新藥奠定基礎(chǔ)。
　　本文主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下：
　　(1)通過高糖誘導(dǎo)人肝癌HepG2細(xì)胞建立穩(wěn)定的體外IR模型。
　　①采用含各濃度高糖培養(yǎng)液干預(yù)細(xì)胞，觀察葡萄糖攝

3、取情況。結(jié)果表明55 mM的干預(yù)組細(xì)胞對(duì)2-NBDG攝取熒光值（0.49）是所有高糖干預(yù)組中最低的，約為正常對(duì)照組的二分之一。在糖消耗實(shí)驗(yàn)中，干預(yù)后12h內(nèi)，高糖(55mM)干預(yù)組與正常對(duì)照組糖消耗量分別為1.65和4.12mM，二者存在極顯著差異。干預(yù)后24h內(nèi)，二者糖耗量分別為6.38、3.5mM，仍存在顯著性差異?？纱_定建模最優(yōu)條件為高糖(55mM)培養(yǎng)液干預(yù)24h，且該模型在24h內(nèi)可保持穩(wěn)定的IR狀態(tài)。②細(xì)胞中ROS水平測(cè)定結(jié)

4、果表明，高糖(55mM)干預(yù)組平均熒光值顯著高于其余各組。可知IR模型中的ROS含量顯著升高，表明胰島素抵抗人肝癌細(xì)胞（IR-HepG2）中氧化應(yīng)激水平升高。
　　(2)研究了仙鶴草活性組分FC和TC對(duì)IR-HepG2細(xì)胞糖代謝的影響。
　?、佼?dāng)FC和TC濃度為2.5μg/mL時(shí)，通過歸一化法計(jì)算出FC和TC組平均攝取熒光值分別0.84和0.75，與模型組（0.51）相比較，二者的平均攝取熒光值分別提高了33%和24%，有顯

5、著性差異（p<0.05），表明二者均能改善IR細(xì)胞對(duì)2-NBDG的攝取情況。②FC和TC濃度為2.5μg/mL時(shí)，其糖耗量分別為5.69和5.17mM，此時(shí)正常對(duì)照組和模型組糖耗量分別為6.43和3.45mM。與模型組比較，F(xiàn)C和TC組的糖耗量顯著升高。上述結(jié)果表明當(dāng)FC和TC在一定濃度下可顯著改善IR細(xì)胞中的糖代謝情況。
　　(3)應(yīng)用生物化學(xué)法和q-PCR技術(shù)研究了仙鶴草活性組分FC和TC對(duì)IR-HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響。

6、
　?、買R模型細(xì)胞中ROS含量隨著FC、TC濃度的升高而逐漸降低。當(dāng)FC和TC組分的干預(yù)濃度為2.5μg/mL時(shí)，評(píng)估ROS含量的平均熒光值分別為80403.3、107841.6，正常對(duì)照組和模型組分別為76767.1、142026.8，此時(shí)與模型組比較，F(xiàn)C和TC干預(yù)組細(xì)胞中ROS含量顯著降低。研究還發(fā)現(xiàn)FC和TC組分對(duì)氧化性損傷標(biāo)志物MDA有相似的調(diào)控作用。此外，二者除了均能有效降低細(xì)胞中ROS和MDA含量，同時(shí)還能增強(qiáng)超氧

7、化物歧化酶SOD的活性。②抗氧化因子Nrf2 mRNA的相對(duì)表達(dá)隨FC、TC組分濃度的增加而升高。當(dāng)FC和TC組分濃度為2.5μg/mL時(shí)，對(duì)Nrf2 mRNA的相對(duì)表達(dá)具有顯著的上調(diào)作用。③GSH-PX、NQO1，HO-1和γ-GCS抗氧化酶基因mRNA的相對(duì)表達(dá)隨FC和TC濃度的升高而升高。與模型組比較，F(xiàn)C和TC組分濃度為2.5μg/mL時(shí)，二者對(duì)四個(gè)抗氧化酶基因mRNA的表達(dá)均表現(xiàn)出顯著的上調(diào)作用。以上結(jié)果表明仙鶴草活性組分FC

8、和TC可通過激活Nrf2-ARE抗氧化信號(hào)通路從而啟動(dòng)下游抗氧化酶基因的表達(dá)，最終達(dá)到改善IR模型細(xì)胞中氧化應(yīng)激的作用。
　　(4)應(yīng)用q-PCR和Western blotting技術(shù)研究了仙鶴草活性組分FC和TC對(duì)IR-HepG2細(xì)胞中JNK和IRS-1/PI3K/Akt信號(hào)途徑的調(diào)控作用。
　?、貸NK mRNA的表達(dá)量隨著FC和TC的濃度的升高而降低。FC組分濃度為2.5μg/mL時(shí)，與模型組比較，F(xiàn)C干預(yù)組中JNK

9、mRNA的相對(duì)表達(dá)量顯著降低（P<0.05）。②IRS-1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量與FC和TC組分濃度呈現(xiàn)劑量依賴性升高。FC和TC組分的濃度為2.5μg/mL時(shí)，與模型組比較，F(xiàn)C和TC干預(yù)組中IRS-1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量顯著升高（P<0.01）；同樣，二者對(duì)Akt mRNA的相對(duì)表達(dá)量有著相似的調(diào)控作用。③與正常對(duì)照組比較，模型組中JNK（Thr183/Tyr185）磷酸化和IRS-1ser307磷酸化水平均顯著升高。FC和TC組