EGCG激活Nrf2-ARE通路對液壓沖擊腦損傷的神經(jīng)保護(hù)作用及其機制.pdf

1、目的：通過觀察表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）對液壓沖擊腦損傷后核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）、caspase-3、caspase-12及炎性細(xì)胞因子表達(dá)變化的影響，探討EGCG在液壓沖擊腦損傷所發(fā)揮的抗凋亡、抗炎的神經(jīng)保護(hù)作用及其機制。
　　方法：
　　1、體重為250g±50g的成年雄性SD大鼠24只，隨機分成3組：假手術(shù)組（Sham Group）、腦損傷溶媒組（TBI+Vehicle Group）以及腦損傷干預(yù)組

2、（TBI+EGCG Group），每組8只。后兩組均實施麻醉后，于顱骨矢狀縫右側(cè)、冠狀縫后約5mm處磨取骨窗，直徑約4mm，常規(guī)行液壓沖擊，其中TBI+Vehicle組磨骨窗、液壓沖擊后給予腹腔注射生理鹽水1ml，TBI+EGCG組磨骨窗、液壓沖擊后給予腹腔注射EGCG50mg/kg+1ml生理鹽水；Sham組大鼠常規(guī)麻醉后，頭顱磨除骨窗，保持硬膜完整，但不行液壓沖擊傷。
　　2、所有動物在24h進(jìn)行mNSS神經(jīng)功能缺損評分，并過

3、度麻醉，斷頭處死后迅速開顱取出腦組織。在大鼠腦組織損傷區(qū)前部切取大約100mg，應(yīng)用Elliot公式測量大鼠腦組織中的含水量；在腦組織損傷區(qū)切取3-4mm左右冠狀腦組織片，將其固定于多聚甲醛中，HE染色觀察組織學(xué)變化、采用免疫組化法檢測Nrf2及凋亡蛋白caspase-3、caspase-12的表達(dá)變化、采用原位末端標(biāo)記法觀察大鼠神經(jīng)細(xì)胞的凋亡變化；將大鼠損傷區(qū)后部的腦組織迅速取出并置于液氮中儲存，應(yīng)用蛋白質(zhì)印跡法來檢測胞核胞漿Nrf2

4、以及凋亡蛋白 caspase-3、caspase-12含量變化，利用酶聯(lián)免疫吸附法檢測炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表達(dá)變化。
　　結(jié)果：
　　1、神經(jīng)功能缺損評分
　　液壓沖擊腦損傷24h后，SD大鼠出現(xiàn)明顯的神經(jīng)功能缺損癥狀，四肢肌張力增高、呼吸暫停、心率增快，弓背、豎毛、前肢屈曲和后肢強直。與Sham組相比較，TBI+Vehicle組在傷后24h神經(jīng)功能缺損評分明顯升高（9.500±0.926)，

5、TBI+EGCG組在傷后24h神經(jīng)功能缺損評分也升高（7.875±0.835），但TBI+EGCG組在傷后24h神經(jīng)功能缺損評分比TBI+Vehicle組降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。
　　2、大鼠腦組織含水量測定
　　與Sham組相比，TBI+Vehicle組在傷后24h腦組織含水量明顯升高(83.305±0.539)， TBI+EGCG組在傷后24h腦組織含水量亦明顯升高（80.846±0.550），但TBI

6、+EGCG組低于TBI+Vehicle組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。
　　3、HE染色組織學(xué)觀察
　　顯微鏡下腦組織切片HE染色可見，Sham組大鼠腦組織結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞排列有序，胞核清晰，核膜完整，無水腫、出血。TBI+Vehicle組大鼠術(shù)后24h可見挫傷灶點狀出血和水腫，挫傷灶周圍腦組織可見組織結(jié)構(gòu)高度疏松，細(xì)胞高度水腫，神經(jīng)元間隙明顯增大，神經(jīng)元變性，細(xì)胞體積明顯增大，胞漿淡染，細(xì)胞空泡樣變明顯，周圍伴隨有炎

7、細(xì)胞浸潤及膠質(zhì)細(xì)胞增生。TBI+EGCG組大鼠術(shù)后24h挫傷灶周圍腦組織亦可見組織結(jié)構(gòu)疏松，細(xì)胞輕度水腫，神經(jīng)元間隙增大，部分神經(jīng)元變性，部分局部出現(xiàn)空泡樣變，但TBI+EGCG組與 TBI+Vehicle組相比較，細(xì)胞水腫顯著減弱。
　　4、免疫組化法測定Nrf2及caspase-3、caspase-12表達(dá)
　　Nrf2蛋白表達(dá)：與Sham組比較，TBI+Vehicle組與TBI+EGCG組大鼠挫傷灶周圍腦組織中神經(jīng)元和

8、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中的Nrf2表達(dá)顯著增高，但TBI+EGCG組（0.391±0.060）高于TBI+Vehicle組（0.282±0.055），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　caspase-3蛋白表達(dá)：與Sham組比較，TBI+Vehicle組與TBI+EGCG組大鼠挫傷灶周圍腦組織中caspase-3陽性細(xì)胞平均光密度值顯著增高，但TBI+EGCG組（0.264±0.029）低于TBI+Vehicle組（0.371±0.

9、038），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　caspase-12蛋白表達(dá)：與Sham組比較，TBI+Vehicle組與TBI+EGCG組大鼠挫傷灶周圍腦組織中caspase-12陽性細(xì)胞平均光密度值顯著增高，但TBI+EGCG組（0.324±0.046）低于TBI+Vehicle組（0.426±0.036），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　5、原位末端標(biāo)記法（TUNEL）檢測凋亡細(xì)胞
　　Sham組中

10、僅能見極少量陽性細(xì)胞。與Sham組相比較，TBI+Vehicle組與 TBI+EGCG組大鼠挫傷灶周圍腦組織中凋亡陽性細(xì)胞數(shù)量顯著增多，TBI+EGCG組（21.374±2.887）凋亡指數(shù)低于TBI+Vehicle組（29.548±2.919），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　6、蛋白質(zhì)印跡法測定胞核、胞漿Nrf2及凋亡蛋白caspase-3、caspase-12含量
　　胞核Nrf2蛋白表達(dá)：與Sham組比較，

11、TBI+Vehicle組與TBI+EGCG組動物挫傷灶周圍腦組織中胞核Nrf2表達(dá)顯著增多，TBI+EGCG組胞核Nrf2蛋白表達(dá)（0.554±0.052）高于TBI+Vehicle組（0.337±0.058），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　胞漿Nrf2蛋白表達(dá)：與Sham組比較，TBI+Vehicle組與TBI+EGCG組動物挫傷灶周圍腦組織中胞漿Nrf2表達(dá)顯著減少，TBI+EGCG組胞漿Nrf2蛋白表達(dá)（0.40

12、5±0.040）低于TBI+Vehicle組（0.537±0.032），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　caspase-3蛋白表達(dá)：與Sham組比較，TBI+Vehicle組與TBI+EGCG組動物挫傷灶周圍腦組織中caspase-3表達(dá)顯著增多，TBI+EGCG組caspase-3蛋白的表達(dá)（0.664±0.023）低于TBI+Vehicle組（0.814±0.028），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　

13、caspase-12蛋白表達(dá)：與Sham組比較，TBI+Vehicle組與TBI+EGCG組動物挫傷灶周圍腦組織中caspase-12表達(dá)顯著增多，TBI+EGCG組caspase-12蛋白表達(dá)（0.545±0.018）低于TBI+Vehicle組（0.764±0.030），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　7ELISA檢測IL-1β、IL-6、TNF-α
　　IL-1β表達(dá)：與Sham組比較，TBI+Vehicle

14、組與TBI+EGCG組大鼠挫傷灶周圍腦組織中IL-1β表達(dá)明顯增高，TBI+EGCG組IL-1β表達(dá)（576.078±55.986）低于TBI+Vehicle組（809.422±68.577），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　IL-6表達(dá)：與Sham組比較，TBI+Vehicle組與TBI+EGCG組大鼠挫傷灶周圍腦組織中IL-6表達(dá)明顯增高，TBI+EGCG組IL-6表達(dá)（251.603±9.500）低于TBI+Veh

15、icle組（306.207±13.524），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　TNF-α表達(dá)：與Sham組比較，TBI+Vehicle組與TBI+EGCG組大鼠挫傷灶周圍腦組織中TNF-α表達(dá)明顯增高，TBI+EGCG組TNF-α表達(dá)（23.167±4.068）低于TBI+Vehicle組（31.800±2.103），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　結(jié)論：
　　1、液壓沖擊腦損傷后出現(xiàn)Nrf2、cas