Nrf2-ARE通路在低劑量LPS處理PC12細(xì)胞中的表達(dá)及其對(duì)脊髓損傷神經(jīng)元的保護(hù)作用研究.pdf

1、脊髓損傷(SCI)是危害人類健康的嚴(yán)重疾病，隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，發(fā)病率增長(zhǎng)明顯。SCI功能缺失主要是由于脊髓神經(jīng)元軸突和神經(jīng)元的靶聯(lián)系信息中斷及SCI誘發(fā)神經(jīng)元病理性死亡及凋亡引起的。保護(hù)神經(jīng)元、促進(jìn)軸突再生是改善SCI病人預(yù)后功能的關(guān)鍵。SCI中的繼發(fā)性損傷由于具有可逆性和可調(diào)控性成為研究的重點(diǎn)，然而繼發(fā)性損傷的機(jī)制繁多，作用復(fù)雜，研究起來十分困難，其中氧化應(yīng)激由于作用明確，且與很多機(jī)制相聯(lián)系，成為目前研究的一個(gè)熱點(diǎn)。
　　

2、中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷存在炎癥反應(yīng)，并且SCI中的炎癥反應(yīng)比創(chuàng)傷性腦損傷的炎癥反應(yīng)更明顯。炎癥反應(yīng)一方面可以加重中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷，另一方面又促進(jìn)損傷的修復(fù)。核因子E2 p45相關(guān)因子2(Nrf2)是一種新發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄因子，在多種刺激作下，Nrf2可以和細(xì)胞核內(nèi)的抗氧化反應(yīng)元件(ARE)結(jié)合，啟動(dòng)抗氧化元件調(diào)控的一系列保護(hù)性分子的表達(dá)。近來的一些研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2/ARE通路在調(diào)控炎癥免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，可能是天然免疫反應(yīng)和機(jī)體存活的關(guān)鍵調(diào)控

3、因子。結(jié)合臨床實(shí)際，我們提出：SCI的炎癥反應(yīng)可能激活Nrf2/ARE抗氧化機(jī)制，適量的炎癥反應(yīng)可能有助于保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞，改善SCI的預(yù)后功能，而其中Nrf2/ARE抗氧化機(jī)制可能發(fā)揮重要作用。
　　 本研究擬以低劑量LPS刺激PC12細(xì)胞，建立體外神經(jīng)元細(xì)胞炎癥刺激模型，探討低劑量LPS對(duì)PC12細(xì)胞Nrf2/ARE通路的影響，以及對(duì)PC12細(xì)胞再灌注損傷的保護(hù)的作用；構(gòu)建Nrf2重組腺病毒載體，一方面通過體外實(shí)驗(yàn)研究Nrf2

4、過表達(dá)對(duì)PC12細(xì)胞增殖影響以及保護(hù)作用，另一方面構(gòu)建大鼠SCI模型，通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究Nrf2重組腺病毒轉(zhuǎn)染對(duì)神經(jīng)元Nrf2/ARE抗氧化機(jī)制，以及對(duì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，大鼠預(yù)后功能的影響。研究?jī)?nèi)容包括以下三部分：
　　 第一部分、低劑量LPS對(duì)PC12細(xì)胞中Nrf2/ARE抗氧化機(jī)制的影響及其在再灌注損傷的保護(hù)作用研究
　　 目的：探討低劑量LPS對(duì)PC12細(xì)胞內(nèi)Nrf2及其下游調(diào)控因子HO-1、NQO1、γ-GCS的影響，

5、并研究Nrf2/ARE抗氧化機(jī)制在低劑量LPS預(yù)處理PC12細(xì)胞再灌注損傷保護(hù)中的作用。
　　 方法：用MTT法確立LPS的安全劑量。采用熒光定量PCR、Western-blot、免疫熒光檢測(cè)低劑量LPS對(duì)PC12細(xì)胞內(nèi)Nrf2 mRNA、總Nrf2蛋白表達(dá)及其在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核分布的影響，并用Western-blot檢測(cè)HO-1、NQO1、γ-GCS的表達(dá)。建立PC12細(xì)胞再灌注損傷模型，采用Hoechst33258染色檢測(cè)低劑

6、量LPS缺血缺氧期預(yù)處理再灌注24h的細(xì)胞凋亡情況；流式細(xì)胞儀檢測(cè)缺血缺氧末及再灌注6h細(xì)胞的ROS；酶法檢測(cè)LDH釋放率；Western-blot檢測(cè)缺血缺氧末細(xì)胞核Nrf2及細(xì)胞HO-1、NQO1、γ-GCS的表達(dá)。
　　 結(jié)果：不大于0.1μg/μl的LPS對(duì)PC12細(xì)胞是安全的(P>0.05)。用0.1μg/μl LPS處理PC12細(xì)胞，Nrf2 mRNA、總Nrf2蛋白表達(dá)6h開始升高(P<0.05)，24h達(dá)峰值(P

7、<0.01)；細(xì)胞質(zhì)Nrf2蛋白表達(dá)1h開始降低(P<0.01)，同時(shí)細(xì)胞核Nrf2蛋白開始升高(P<0.05)；免疫熒光顯示細(xì)胞核內(nèi)的Nrf2蛋白3h比1h表達(dá)明顯；細(xì)胞內(nèi)HO-1、NQO1、γ-GCS表達(dá)相應(yīng)升高，峰值均在24h。在PC12細(xì)胞再灌注損傷模型中發(fā)現(xiàn)，再灌注24h，低劑量LPS預(yù)處理組細(xì)胞凋亡數(shù)明顯減少，以0.05μg/μl LPS組最為明顯(與未加LPS組比較P<0.05)，LDH的釋放率相應(yīng)降低。缺血缺氧末測(cè)得的細(xì)

8、胞內(nèi)ROS表達(dá)隨LPS劑量增加而增加，再灌注6h，ROS出現(xiàn)隨LPS劑量增加先降低后升高趨勢(shì)，其中0.025μg/μl LPS組降低最為明顯(與未加LPS組比較P<0.05)；缺血缺氧末細(xì)胞核Nrf2及細(xì)胞HO-1、NQO1、γ-GCS表達(dá)均增高，其中以0.05μg/μl LPS組最為明顯。
　　 結(jié)論：低劑量的LPS能夠促進(jìn)PC12細(xì)胞內(nèi)Nrf2的轉(zhuǎn)錄、翻譯，以及從細(xì)胞質(zhì)到細(xì)胞核的轉(zhuǎn)移，激活Nrf2/ARE抗氧化機(jī)制；低劑量L

9、PS預(yù)處理PC12細(xì)胞有助于細(xì)胞抵抗再灌注損傷，而其中Nrf2/ARE抗氧化機(jī)制可能發(fā)揮了重要作用。
　　 第二部分、Nrf2重組腺病毒構(gòu)建及其對(duì)PC12細(xì)胞的影響
　　 目的：構(gòu)建Nrf2重組腺病毒載體，并觀察檢測(cè)其對(duì)PC12細(xì)胞的影響。
　　 方法：將腺病毒穿梭質(zhì)粒pAV-MCMV-GFP-Nrf2與腺病毒輔助包裝質(zhì)粒pBHG lox△E1，3 Cre共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，得到Nrf2重組腺病毒，RT-PC

10、R鑒定目的基因的表達(dá)，并進(jìn)行擴(kuò)增、純化及滴度鑒定。用重組腺病毒轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞，Western-blot檢測(cè)PC12細(xì)胞中Nrf2、HO-1、NQO1、γ-GCS的表達(dá)；顯微鏡下觀察Nrf2重組腺病毒對(duì)PC12細(xì)胞增殖的影響及對(duì)LPS的抵抗能力；流式細(xì)胞儀檢測(cè)Nrf2過表達(dá)對(duì)PC12細(xì)胞生長(zhǎng)周期的影響；Western-blot檢測(cè)LPS刺激下IL-1β、Caspase-3的表達(dá)變化。
　　 結(jié)果：Nrf2重組腺病毒構(gòu)建成功，PC

11、R結(jié)果顯示與穿梭質(zhì)粒pAV-MCMV-GFP-Nrf2目的基因一致，擴(kuò)增純化可以得到7.9×1010pfu/ml病毒懸液。將Nrf2重組腺病毒轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其能促進(jìn)PC12細(xì)胞中Nrf2(細(xì)胞質(zhì)/細(xì)胞核)、HO-1、NQO1、γ-GCS的表達(dá)，并抑制PC12細(xì)胞增殖，抵抗LPS的毒性損傷作用，降低IL-1β、Caspase-3的表達(dá)。
　　 結(jié)論：成功構(gòu)建Nrf2重組腺病毒；Nrf2重組腺病毒轉(zhuǎn)染能促進(jìn)PC12細(xì)胞Nrf

12、2/ARE抗氧化因子的表達(dá)，抑制細(xì)胞增殖，增強(qiáng)PC12細(xì)胞抗凋亡/壞死及抗炎能力。
　　 第三部分、Nrf2對(duì)脊髓損傷大鼠脊髓神經(jīng)元的保護(hù)作用
　　 目的：觀察檢測(cè)Nrf2過表達(dá)對(duì)脊髓損傷大鼠脊髓神經(jīng)元的保護(hù)作用。
　　 方法：將160只SD大鼠隨機(jī)分為4組：A組(假手術(shù)組)，B組(SCI組)，C組(Ad-Nrf2組)，D組(Ad-GFP組)，建立動(dòng)物模型。觀察術(shù)后大鼠的運(yùn)動(dòng)功能，并行BBB評(píng)分；大體觀察脊髓標(biāo)本

13、，冰凍切片熒光顯微鏡下觀察腺病毒的轉(zhuǎn)染情況；組織切片HE染色，觀察大鼠脊髓組織的形態(tài)學(xué)變化，水腫、炎癥反應(yīng)情況；免疫組化法檢測(cè)組織切片中Nrf2、HO-1、NQO1、γ-GCS表達(dá)；TUNEL法檢測(cè)組織切片中神經(jīng)細(xì)胞的凋亡；免疫組化法檢測(cè)組織切片中GAP-43的表達(dá)。
　　 結(jié)果：C組大鼠術(shù)后2w開始運(yùn)動(dòng)功能有明顯改善(與B、D組比較P<0.05)。大體觀察發(fā)現(xiàn)，術(shù)后4w C組脊髓保留相對(duì)較好。冰凍切片熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)術(shù)后1

14、d C組既有較強(qiáng)的綠色熒光表達(dá)，主要分布在注射階段，術(shù)后3d，綠色熒光表達(dá)最強(qiáng)，損傷區(qū)熒光明顯，之后綠色熒光表達(dá)逐漸減弱，術(shù)后4w仍可見少量綠色熒光表達(dá)。HE顯示術(shù)后2w、4w C組脊髓炎性反應(yīng)較輕，神經(jīng)元保留較多。免疫組化發(fā)現(xiàn)C組損傷脊髓中Nrf2、HO-1、NQO1、γ-GCS表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)增多，著色較深，術(shù)后3d達(dá)峰值(與B、D組比較P<0.01)；GAP-43表達(dá)陽性細(xì)胞增多，7d達(dá)峰值(與B、D組比較P<0.01)。TUNEL