砷誘導(dǎo)皮膚角化紊亂中Nrf2-ARE信號通路的作用及差異蛋白研究.pdf

1、目的：本研究通過體內(nèi)、體外實驗對家兔及人角質(zhì)形成細(xì)胞染砷，了解砷在皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞和皮膚組織中的代謝規(guī)律及內(nèi)暴露劑量，觀察砷對皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞和皮膚組織的影響，探討 Nrf2-ARE信號通路在砷誘導(dǎo)皮膚角化紊亂中的作用及砷氧化損傷的皮膚毒性機制；通過對砷誘導(dǎo)皮膚角化紊亂差異蛋白的研究，在蛋白質(zhì)分子水平探討砷致皮膚角化紊亂的機制并尋找敏感標(biāo)記物。為砷性皮膚損傷的防治提供新的思路及科學(xué)依據(jù)。
　　方法：⑴采用MTT還原法檢測HacaT

2、細(xì)胞生長情況，確定亞砷酸鈉的LC50及染毒濃度，染毒濃度分別為24h LC50的1/50、1/20、1/10，即1.30μmol/L、3.25μmol/L、和6.50μmol/L；觀察時間為24h、48h、72h；⑵流式細(xì)胞儀檢測HacaT細(xì)胞的凋亡情況；⑶將30只健康成年清潔級雄性家兔隨機分為5組，每組6只，分別為對照組（去離子水）及亞砷酸鈉染毒組。采用自由飲水方式連續(xù)染毒12周。染毒劑量分別為LD50的1/100、1/50、1/20

3、、1/10，即L：0.13mg/千克體重（kg.w）、M：0.26mg/（kg.w）、MH：0.65mg/（kg.w）和H：1.30mg/（kg.w）；⑷染毒12周結(jié)束后，家兔背部同一部位皮膚取樣，電鏡下觀察皮膚細(xì)胞及組織的形態(tài)學(xué)改變；⑸采集家兔處死前24h尿樣，并取家兔肝臟組織，采用高效液相色譜-氫化物發(fā)生原子熒光光譜（HPLC-HGAFS）法檢測家兔尿、肝臟、皮膚的iAsⅢ、iAsⅤ、一甲基胂酸（Monomethylarsonic

4、acid，MMA）和二甲基胂酸（Dimethylarsinic acid，DMA）含量；⑹通過實時熒光定量PCR（Real-time polymerase chain reaction， RT-PCR）檢測染砷HacaT細(xì)胞和家兔皮膚Nrf2 mRNA的表達(dá)水平；⑺通過相應(yīng)試劑盒方法檢測染砷家兔皮膚CAT、8-OHdG、MPO、GSH-Px、GST、SOD和MDA及HO-1含量或活力，總蛋白采用BCA法檢測；⑻用雙向凝膠電泳（two-d

5、imensional gel electrophoresis，2-DE）篩選砷誘導(dǎo)角化紊亂家兔皮膚的差異蛋白點，膠內(nèi)酶切后，利用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜（Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry，MALDI-TOF-MS）結(jié)合NCBI（nr）非冗余數(shù)據(jù)庫檢索對差異蛋白進(jìn)行鑒定；⑼用RT-PCR檢測 HacaT細(xì)胞CK1

6、、CK10和家兔皮膚CK1、CK10、CK2及蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶（protein disulfide isomerase，PDI）mRNA的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：①1.30μmol/L亞砷酸鈉染毒48h能顯著促進(jìn)HacaT細(xì)胞增殖；3.25μmol/L亞砷酸鈉染毒96h、6.25μmol/L亞砷酸鈉染毒72h顯著抑制HacaT細(xì)胞增殖（P均＜0.05）；②1.30μmol/L亞砷酸鈉能抑制HacaT細(xì)胞凋亡，24h時凋亡率最低；3

7、.25μmol/L、6.25μmol/L亞砷酸鈉染毒48h、72h可使HacaT細(xì)胞凋亡率逐漸升高（P均＜0.05）；③電鏡下可見，和對照組相比各染毒組家兔皮膚細(xì)胞形態(tài)和表皮尤其是皮膚角質(zhì)層結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變。0.13mg/（kg.w）砷染毒12周即可出現(xiàn)角化紊亂，隨砷染毒劑量的升高，家兔皮膚細(xì)胞形態(tài)改變及角化紊亂程度加重；④染毒12周后家兔尿中總砷、iAsⅢ及DMA含量水平隨砷染毒劑量的升高呈逐漸升高的趨勢，與對照組比較，H砷染毒劑量組總

8、砷、iAsⅢ及DMA含量水平升高（P均＜0.05）。iAsⅤ含量水平無明顯變化趨勢。MMA含量水平隨砷染毒劑量升高呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢，與對照組比較，MH及H砷染毒劑量組其含量水平升高（P＜0.05）。與對照組比較，各砷染毒劑量組PMI值均升高（P＜0.05）。與對照組比較，除L砷染毒劑量組外，其余砷染毒劑量組SMI值均升高（P＜0.05）；各染毒組家兔皮膚總砷及 DMA含量高于對照組，且隨染毒劑量升高而升高（P＜0.05）；各形態(tài)砷中，

9、DMA含量最高。iAsⅢ含量除MH組外，各染毒組高于對照組；iAsⅤ含量各組均高于對照組，MMA含量L組和H低于對照組，MH組高于對照組（P均＜0.05）。兔肝臟中總砷含量水平隨砷染毒劑量的升高呈逐漸升高的趨勢，與對照組比較，M、MH、H砷染毒劑量組總砷含量水平升高（P＜0.05）。肝臟中iAsⅢ含量在各組間沒有統(tǒng)計學(xué)差異；肝臟中 iAsⅤ含量 M組與其他組相比升高（P＜0.05）。肝臟中 MMA含量在各組間沒有統(tǒng)計學(xué)差異；肝臟中 DM

10、A含量在各組中不同，與對照組相比，MH和H染砷劑量組其含量升高（P＜0.05）。家兔皮膚和尿中砷以DMA形態(tài)為主，肝臟中各種形態(tài)砷分布未發(fā)現(xiàn)規(guī)律；隨著砷染毒劑量升高，皮膚DMA所占比例有升高的趨勢。皮膚和尿的總砷和DMA含量與肝臟總砷和DMA含量呈正相關(guān)；⑤亞砷酸鈉染毒能使HacaT細(xì)胞Nrf2 mRNA表達(dá)發(fā)生改變，1.30μmol/L亞砷酸鈉染毒使mRNA表達(dá)上調(diào)，隨著染毒時間延長、染毒濃度增加使mRNA表達(dá)逐漸下調(diào)（P＜0.05）

11、。砷染毒48h后HacaT細(xì)胞Nrf2 mRNA表達(dá)水平與細(xì)胞活性呈正相關(guān)關(guān)系；L、M組家兔皮膚Nrf2 mRNA的表達(dá)上調(diào)；MH、H組皮膚Nrf2 mRNA的表達(dá)下調(diào)，其中L、H組與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。⑥染砷家兔皮膚8-OHdG在H組，MDA在MH和H組比對照升高（P＜0.05）；CAT和HO-1在M、MH和H組，GSH-Px在H組比對照降低（P＜0.05）；GST在H組比對照升高（P＜0.05）；SOD和MP

12、O在各組無明顯差異。染砷家兔皮膚Nrf2 mRNA表達(dá)與HO-1、GSH-Px水平呈正相關(guān)關(guān)系，與MDA、8-OHdG水平呈負(fù)相關(guān)關(guān)系；⑦2-DE電泳蛋白斑點清晰可見，各組蛋白斑點數(shù)在100-200之間，其中對照組蛋白斑點數(shù)為119，而其余4組蛋白斑點均為129個并全部匹配。對照組和其余各組的蛋白斑點匹配率為92.24％。與對照相比差異表達(dá)的蛋白點有45個，鑒定出20種差異蛋白。其中細(xì)胞角蛋白Ⅱ型蛋白、GST-P和PDI可能與砷的皮膚毒

13、性有關(guān)；⑧細(xì)胞角蛋白Ⅱ型蛋白在各砷染毒組家兔皮膚表達(dá)，而在對照組中無表達(dá)；HacaT染砷后CK1、CK10 mRNA表達(dá)發(fā)生改變，1.30μmol/L亞砷酸鈉染毒能使mRNA表達(dá)上調(diào)，隨著染毒時間延長、染毒濃度增加mRNA表達(dá)逐漸下調(diào)（P＜0.05）；染砷家兔皮膚CK1、CK2、CK10 mRNA在L組表達(dá)上調(diào)，H組表達(dá)下降至正?；蛳抡{(diào)（P＜0.05）。染砷家兔皮膚PDI蛋白表達(dá)量隨染砷劑量升高而先下調(diào)后上調(diào)；PDI mRNA在MH和H

14、組，隨染砷劑量升高表達(dá)量上升（P＜0.05）。
　　結(jié)論：亞砷酸鈉可在動物角質(zhì)形成細(xì)胞和皮膚組織中發(fā)生生物轉(zhuǎn)化并形成一系列代謝產(chǎn)物，隨染毒劑量增加，皮膚砷負(fù)荷增加，可致皮膚氧化損傷，并引起角質(zhì)形成細(xì)胞和皮膚組織 Nrf2表達(dá)變化，并隨染毒時間和濃度變化呈雙向性；砷通過調(diào)控Nrf2水平繼而影響皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖和凋亡及皮膚組織Nrf2-ARE信號通道下游酶的改變，皮膚氧化-抗氧化平衡被破壞，出現(xiàn)角化紊亂等形態(tài)學(xué)改變。砷代謝及Nr