Nrf2-ARE信號通路參與小細胞肺癌多藥耐藥相關蛋白1的表達調(diào)控.pdf

1、第一部分 Nrf2促進人耐藥肺小細胞癌細胞H69AR的耐藥
　　目的:明確Nrf2對人耐藥肺小細胞癌細胞H69AR的耐藥影響。
　　方法:選用兩株耐藥性不同的肺小細胞癌腫瘤細胞株:藥物敏感型細胞株H69和耐藥株H69AR，應用realtime PCR及Western方法比較Nrf2，MRPs及Ⅱ相解毒酶的表達差異;應用MTT檢測兩株細胞的藥物敏感性差異;采用Nrf2 siRNA雙鏈寡核苷酸干擾耐藥肺小細胞癌H69AR細胞;隨

2、后應用Western方法檢測H69AR細胞干擾前后Nrf2，MRP1的表達差異;應用MTT檢測耐藥株H69AR細胞在Nrf2干擾前后藥物敏感性的差異。
　　結果:相對于H69細胞，H69AR細胞中Nrf2及Mrp1 mRNA及蛋白均高表達，且耐藥性隨著Nrf2、Mrp1表達的增高而耐藥性增強。Nrf2 siRNA干擾后，可以下調(diào)肺小細胞癌耐藥株H69AR細胞內(nèi)Mrp1的蛋白表達，同時相對干擾前，H69AR細胞對化療藥物由耐藥變?yōu)槊?/p>

3、感。
　　小結:Nrf2可以通過上調(diào)人耐藥肺小細胞癌細胞H69AR細胞內(nèi)的MRP1蛋白的表達，促進其耐藥。
　　第二部分 Nrf2通過直接與Mrp1基因啟動子區(qū)的ARE位點結合，促進Mrp1的表達
　　目的:探索Nrf2-ARE通路如何調(diào)控Mrp1基因表達，明確Mrp1是否為Nrf2的下游靶基因。
　　方法:在人Mrp1基因5'啟動子區(qū)域，搜尋可能的ARE序列。化學合成野生型ARE序列以及針對ARE序列上的關鍵位

4、點進行點突變;構建相應的ARE野生型熒光素酶報告基因質(zhì)粒，及ARE突變型螢光素酶報告基因質(zhì)粒，并轉染至MDA-MB-231細胞內(nèi)，觀察Nrf2刺激后的熒光素酶活性的改變。設計針對Mrp1基因啟動子區(qū)域ARE序列的引物，通過染色體免疫共沉淀法，明確轉錄因子Nrf2與Mrp1啟動子區(qū)的ARE位點直接結合。
　　結果:在人Mrp1基因5'啟動子區(qū)域，發(fā)現(xiàn)兩個可能的ARE位點，被命名為ARE1及ARE2。熒光素酶報告基因實驗提示過表達Nr

5、f2可增加ARE1及ARE2介導的啟動子活性的誘導，而突變型ARE1及ARE2則降低了Nrf2誘導的啟動子活性。231細胞染色體免疫共沉淀顯示，在tBHQ刺激誘導核轉錄因子Nrf2高表達后，這些過表達的Nrf2轉錄因子隨即被招募至Mrp1基因啟動子區(qū)的ARE1及ARE2位點。同時，比較CHIP實驗證實，與H69細胞相比，H69AR細胞中與ARE1及ARE2結合的Nrf2更多。
　　小結:Mrp1基因啟動子區(qū)發(fā)現(xiàn)ARE1及ARE2位

6、點。核轉錄因子Nrf2可以與Mrp1基因的ARE1及ARE2位點直接結合。Mrp1為Nrf2靶基因。
　　第三部分人癌組織中Nrf2，NQO1及Mrp1的表達及其相互關系
　　目的:闡明人小細胞肺癌、乳腺癌、胃癌、大腸癌組織中Nrf2，NQO1及Mrp1的表達以及三者的相關性。
　　方法:采用IHC的方法檢測40例人癌組織標本（小細胞肺癌、乳腺癌、胃癌、大腸癌組織各10例）中Nrf2、NQO1及Mrp1的表達;IHC染

7、色切片應用i-Solution軟件將三者在癌組織中的表達進行分析和定量;Pearson's相關分析比較三者表達的兩兩相關性。
　　結果:Nrf2蛋白主要為細胞胞核內(nèi)表達，細胞漿內(nèi)有部分表達。MRP1在胞漿和胞膜均有表達，而NQO1主要表達在細胞質(zhì)中;染色數(shù)據(jù)和統(tǒng)計分析顯示，三個指標在癌組織中的表達遠遠高于癌旁組織;MRP1的表達與Nrf2有很強的相關性，經(jīng)Pearson's相關分析，兩者之間的相關系數(shù)在小細胞肺癌、乳腺癌、胃癌及大