Nrf2-ARE信號(hào)通路與自噬在卵巢癌順鉑耐藥的相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、鉑類耐藥是卵巢癌治療的一大難題，其發(fā)生機(jī)制及如何逆轉(zhuǎn)耐藥是多年來(lái)研究的熱點(diǎn)。近年來(lái)人們發(fā)現(xiàn)一些與靶點(diǎn)作用無(wú)關(guān)，卻與腫瘤耐藥相關(guān)的影響因素，例如自噬、Nrf2分子等。但是，這些因素參與卵巢癌耐藥的機(jī)制尚不明了。因此，深入研究相關(guān)機(jī)制為尋找潛在靶點(diǎn)具有重要的臨床意義。
　　自噬(autophagy)是一種不同于凋亡的程序性死亡。當(dāng)缺氧或饑餓時(shí)，細(xì)胞可形成雙層皺褶包裹受損的細(xì)胞器及大分子物質(zhì)，利用自身溶酶體進(jìn)行消化，維持能量代謝平衡。自

2、噬功能的異?？蓪?dǎo)致疾病的發(fā)生，如衰老、神經(jīng)退行性病變等。自噬與腫瘤的研究頗具爭(zhēng)議，部分研究表明自噬可抑制腫瘤形成，而其他研究認(rèn)為自噬可促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)。自噬與腫瘤耐藥的研究有相似的現(xiàn)象，不同的是大部分研究表明自噬活性增高與腫瘤耐藥相關(guān)，而小部分實(shí)驗(yàn)表明耐藥可損傷自噬功能。但自噬與卵巢癌耐藥關(guān)系如何，罕見(jiàn)報(bào)道。
　　Nrf2-ARE信號(hào)通路(NF-E2-related factor2-antioxidant responseelemen

3、t)是存在細(xì)胞中抗氧化應(yīng)激的信號(hào)通路。當(dāng)細(xì)胞受到氧化應(yīng)激時(shí)，Nrf2分子高表達(dá)從而引起下游抗氧化反應(yīng)元件的活化，發(fā)揮保護(hù)細(xì)胞的功能。近年研究表明高表達(dá)的Nrf2分子與腫瘤耐藥相關(guān)。我們課題組前期工作發(fā)現(xiàn)耐藥的卵巢癌細(xì)胞高表達(dá)Nrf2，下調(diào)Nrf2水平可提高細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。但是Nrf2-ARE信號(hào)通路參與卵巢癌鉑類耐藥的分子機(jī)制不十分清楚。
　　綜上，我們課題組假想自噬與Nrf2-ARE信號(hào)通路在卵巢癌耐藥中可能存在某種調(diào)節(jié)。本

4、課題主要研究自噬及Nrf2-ARE信號(hào)通路在卵巢癌鉑類耐藥中的作用及初步探討二者之間可能存在的調(diào)節(jié)機(jī)制。
　　第一部分自噬在卵巢癌鉑類耐藥中的相關(guān)性研究
　　目的:探討自噬對(duì)卵巢癌細(xì)胞鉑類敏感性的影響。
　　方法:以卵巢癌敏感細(xì)胞A2780及耐藥細(xì)胞A2780cp為主要研究對(duì)象，經(jīng)或不經(jīng)順鉑處理后，通過(guò)Western blot、免疫熒光及電鏡比較兩種細(xì)胞間的自噬水平。對(duì)自噬水平高的細(xì)胞，通過(guò)自噬藥物抑制劑3-MA或重要

5、自噬基因beclin1 siRNA轉(zhuǎn)染下調(diào)自噬水平，檢測(cè)細(xì)胞對(duì)順鉑敏感性及凋亡水平的改變。
　　結(jié)果:耐藥細(xì)胞A2780cp對(duì)順鉑的24小時(shí)半數(shù)抑制濃度是敏感細(xì)胞A2780的6.5倍，為卵巢癌鉑類耐藥研究提供了理想的研究模型。A2780cp細(xì)胞中自噬蛋白LC3Ⅰ/Ⅱ、beclin1蛋白表達(dá)顯著高于A2780細(xì)胞;A2780cp細(xì)胞中免疫熒光LC3表達(dá)高于A2780細(xì)胞;在相同處理?xiàng)l件下，A2780cp細(xì)胞中自噬小體的數(shù)量顯著多于A

6、2780細(xì)胞。經(jīng)3-MA與順鉑聯(lián)合處理，A2780cp細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性顯著增加，但對(duì)順鉑引起的凋亡無(wú)明顯改變;經(jīng)beclin1 siRNA轉(zhuǎn)染下調(diào)自噬水平后，A2780cp細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性及凋亡均顯著增加。
　　結(jié)論:卵巢癌耐藥細(xì)胞的自噬水平高于敏感細(xì)胞。下調(diào)自噬水平，可增加耐藥細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。
　　第二部分 Nrf2-ARE信號(hào)通路在卵巢癌鉑類耐藥的作用及對(duì)自噬潛在調(diào)控機(jī)制的初步探討
　　目的:探討Nrf2-

7、ARE信號(hào)通路對(duì)卵巢癌細(xì)胞順鉑敏感性的影響及與自噬可能的調(diào)控機(jī)制。
　　方法:通過(guò)Real-time PCR及Western blot方法比較卵巢癌敏感細(xì)胞A2780及耐藥細(xì)胞A2780cp中Nrf2-ARE信號(hào)通路中重要基因Nrf2、Keap1、NQ01及HO-1中的表達(dá)差異。對(duì)于Nrf2高表達(dá)的細(xì)胞，經(jīng)Nrf2 siRNA轉(zhuǎn)染后檢測(cè)細(xì)胞存活率及凋亡水平的改變。同時(shí)檢測(cè)Nrf2 siRNA轉(zhuǎn)染后細(xì)胞自噬水平發(fā)生的變化。
　

8、　結(jié)果:在mRNA水平，耐藥細(xì)胞A2780cp中Nrf2、Keap1、NQ01及HO-1表達(dá)水平均高于敏感細(xì)胞A2780（除NQ01外，其他P＜0.05）。Western blot結(jié)果與mRNA相一致。經(jīng)Nrf2 siRNA下調(diào)耐藥細(xì)胞中Nrf2水平，NQ01、HO-1表達(dá)水平隨之下調(diào)，A2780cp細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性增加，同時(shí)Tunel染色后凋亡小體形成數(shù)目顯著增多，流式細(xì)胞儀檢測(cè)的由順鉑誘導(dǎo)的凋亡水平明顯增加。前已證實(shí)耐藥細(xì)胞中自噬

9、水平高于敏感細(xì)胞，通過(guò)Western blot檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白，耐藥細(xì)胞A2780cp中Atg3、Atg5、Atg12及p62的表達(dá)均高于A2780。在A2780cp細(xì)胞中，Nrf2 siRNA轉(zhuǎn)染后，自噬基因Atg3、Atg5、Atg6、Atg12及p62在mRNA及蛋白水平均隨之下降，同時(shí)Nrf2下調(diào)后細(xì)胞的自噬小體形成數(shù)目顯著減少。
　　結(jié)論:卵巢癌耐藥細(xì)胞中Nrf2-ARE信號(hào)通路活性高于敏感細(xì)胞。下調(diào)Nrf2水平，可增加