A2M和CRABP2基因介導(dǎo)Fas凋亡信號通路逆轉(zhuǎn)卵巢癌鉑類耐藥的研究.pdf

1、目的：本課題組前期成功利用卵巢癌SKOV3細(xì)胞株建立了卵巢癌的裸鼠順鉑耐藥模型，得到了卵巢癌順鉑獲得性耐藥細(xì)胞株SKOV3-GFP/DDPⅡ，并對其耐藥過程進(jìn)行了動態(tài)系統(tǒng)生物學(xué)分析，整和基因表達(dá)譜及蛋白質(zhì)譜的數(shù)據(jù)信息后，篩選到α2巨球蛋白(A2M)和視黃酸結(jié)合蛋白Ⅱ(CRABP2)在各處理組的耐藥細(xì)胞中均顯著降低。本實(shí)驗(yàn)繼續(xù)前期的研究，將A2M和CRABP2導(dǎo)入TCGA提供的499例卵巢癌人類組織全基因組表達(dá)譜數(shù)據(jù)中，分別分析它們與卵巢

2、癌患者鉑類化療耐藥和臨床預(yù)后等的相關(guān)性，為將A2M和CRABP2作為潛在的卵巢癌鉑類耐藥途徑的上游調(diào)控分子提供臨床依據(jù)。另外，進(jìn)一步在基因和蛋白水平上對A2M和CRABP2進(jìn)行功能驗(yàn)證，并探討它們表達(dá)失衡后對下游耐藥相關(guān)信號通路的影響，為尋找逆轉(zhuǎn)卵巢癌順鉑耐藥的新的靶點(diǎn)奠定基礎(chǔ)。
　　方法：利用TCGA數(shù)據(jù)庫分析A2M和CRABP2基因的mRNA表達(dá)在敏感和耐藥患者中的差異;ROC曲線分析二者的表達(dá)是否與耐藥相關(guān);采用Pearso

3、n相關(guān)分析二者的表達(dá)與卵巢癌患者的總生存期，化療間隔生存期和無進(jìn)展生存期的關(guān)系;Cox regression分析A2M和CRABP2基因診斷卵巢癌患者耐藥的敏感性;最后將TCGA提供的283例卵巢癌患者全基組表達(dá)譜數(shù)據(jù)分別分為A2M和CRABP2高低表達(dá)兩個組，Kaplan-Meierw分別分析卵巢癌患者鉑類化療間隔生存期在A2M和CRABP2高低表達(dá)組之間的差異。利用課題組前期建立的卵巢癌順鉑獲得性耐藥的SKOV3-GFP/DDPⅡ細(xì)

4、胞株和順鉑敏感的SKOV3-GFP親本細(xì)胞株分別在裸鼠皮下種植成瘤，成瘤后分次順鉑體內(nèi)干預(yù)，實(shí)時熒光定量PCR和Westem Blot驗(yàn)證分次順鉑干預(yù)的移植瘤組織中A2M和CRABP2的mRNA和蛋白表達(dá)，檢測瘤組織中與細(xì)胞增殖及凋亡相關(guān)的主要通路中重要節(jié)點(diǎn)基因的表達(dá)水平，分析二者的表達(dá)變化對下游信號通路表達(dá)變化的影響。利用PWPI和pSico慢病毒表達(dá)系統(tǒng)和SKOV3-GFP/DDPⅡ細(xì)胞株，構(gòu)建CRABP2基因過表達(dá)的順鉑耐藥細(xì)胞株

5、SKOV3-GFP/DDPⅡ-CRABP2，并且采用mcherry紅色熒光標(biāo)記，CCK試劑盒分析過表達(dá)CRABP2后細(xì)胞的IC50、耐藥指數(shù)的變化，Westem Blot檢測CRABP2基因過表達(dá)后對細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)蛋白表達(dá)和下游Fas細(xì)胞凋亡信號通路上節(jié)點(diǎn)基因的蛋白表達(dá)的影響。
　　結(jié)果：相對于敏感病例，A2M和CRABP2基因在鉑類耐藥患者表達(dá)下降(P＜0.05，P＜0.05)，與耐藥相關(guān)(P＜0.05，P＜0.05)，與卵巢

6、癌患者總生存期，化療間隔生存期和無進(jìn)展生存期高度相關(guān)(P＜0.00，P＜0.00)，它們的表達(dá)量越高，患者的生存期越長;Cox regression分析結(jié)果也表明二者可以作為獨(dú)立的卵巢癌患者預(yù)后的指標(biāo)。ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)A2M和CRABP2的表達(dá)與卵巢癌患者的鉑類耐藥相關(guān)(Area=0.969，0.980)。Kaplan-Meierw分析結(jié)果證實(shí)A2M和CRABP2高低表達(dá)組的患者的鉑類化療間隔生存時間均有顯著差異(P＜0.00)。細(xì)胞

7、凋亡相關(guān)的Fas信號通路上重要節(jié)點(diǎn)基因Fas，F(xiàn)ADD，Caspase10，Caspase9和Caspase3隨順鉑注射次數(shù)的增加在耐藥組織中相對低表達(dá)(P＜0.00)，而其下游與DNA修復(fù)相關(guān)的基因PARP1隨順鉑注射次數(shù)的增加在耐藥的移植瘤組織中相對高表達(dá)(P＜0.05)。所有這些基因在移植瘤組織中的蛋白表達(dá)也呈現(xiàn)與mRNA大致一致的趨勢。不同次數(shù)順鉑作用后的瘤組織中A2M、CRABP2的mRNA相對表達(dá)量與Fas信號通路節(jié)點(diǎn)基因和

8、下游PARP1的表達(dá)變化均存在相關(guān)性(P＜0.05，P＜0.00)。
　　相對于SKOV3-GFP/DDPⅡ和空白對照的SKOV3-GFP/DDPⅡ-Blank細(xì)胞株，過表達(dá)CRABP2的SKOV3-GFP/DDPⅡ-CRABP2細(xì)胞株對于順鉑的IC50均顯著降低(P＜0.00)，耐藥指數(shù)明顯下降(P＜0.00);其細(xì)胞周期被顯著抑制，細(xì)胞凋亡被激活:細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶CDK4、CDK6和CDK2以及細(xì)胞周期蛋白cyclin

9、D1的表達(dá)在SKOV3-GFP/DDPⅡ-CRABP2細(xì)胞中顯著減弱(P＜0.00)，而細(xì)胞周期的阻斷劑p27 kip1的蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng)(P＜0.00);Fas凋亡信號通路上的節(jié)點(diǎn)基因Fas、FADD、Caspase10、Caspase9和Caspase3的蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng)(P＜0.00)，而凋亡信號通路下游的DNA修復(fù)相關(guān)基因PARP1的蛋白表達(dá)則顯著降低(P＜0.05)，即過表達(dá)CRABP2基因后的卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞恢復(fù)了對順鉑的