小干擾RNA靶向EGFR基因逆轉(zhuǎn)卵巢癌細(xì)胞順鉑耐藥的研究.pdf

1、目的：探討載體表達(dá)的小干擾RNA(siRNA)對(duì)卵巢癌耐藥細(xì)胞SKOV-3/DDPEGFR基因表達(dá)的影響以及逆轉(zhuǎn)其順鉑耐藥的可行性。
　　 方法：根據(jù)EGFRmRNA序列設(shè)計(jì)特異性小發(fā)卡狀RNA(shRNA)插入序列，體外合成該序列后將其定向克隆入線性化質(zhì)粒pSilencerTM2.1-U6neo，運(yùn)用DNA測(cè)序證明插入序列的正確性。利用脂質(zhì)體法介導(dǎo)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入人卵巢癌耐藥細(xì)胞株SKOV-3/DDP。實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組、空白

2、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、非特異性轉(zhuǎn)染組和特異性轉(zhuǎn)染組。采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)EGFRmRNA的表達(dá)；使用免疫細(xì)胞化學(xué)法(ICC)檢測(cè)EGFR蛋白的表達(dá)；使用四甲基偶氮唑藍(lán)法(MTT)測(cè)定各組細(xì)胞對(duì)順鉑的半數(shù)抑制濃度(IC50)，從而測(cè)定細(xì)胞對(duì)順鉑敏感性的變化。結(jié)果雙向重復(fù)DNA測(cè)序證實(shí)EGFR質(zhì)粒表達(dá)載體中shRNA插入序列完全正確。RT-PCR和免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果證明此表達(dá)載體可特異性抑制EGFR基因表達(dá)，EGFRshRNA轉(zhuǎn)染