帶hTERT啟動子的腺病毒干擾ERCC1基因表達逆轉(zhuǎn)卵巢癌順鉑耐藥的研究.pdf

1、Y1407411分類號：R71175密級：學位類別；科學學位√口專業(yè)學位口◎?qū)W校代碼：學號：1006220051073又灃醬科^垮TlANJlNMEDICAlIUNlVERSITY博士學位論文DoCToRALDISSERTATIoN論文題目：帶hTERT啟動予的腺病毒干擾ERCCl基因表達逆轉(zhuǎn)卵巢癌順鉑耐藥的研究TITLEStudyonadenoviruswithhTERTpromoterinterferingexpressionofE

2、RCCltoreverseeisplalinresistanceinovariancancercelllines一級學科：臨床醫(yī)學二級學科：婦產(chǎn)科學論文作者：任亞娟指導教師：糜若然教授導師組成員：瞿全新教授天津醫(yī)科大學研究生院二oO)t年五月天津醫(yī)科大學博士學位論文目的：構(gòu)建帶有hTERTpromoter的重組質(zhì)粒，并檢測hTERTpromoter表達的特異性。方法：1、使用KpnI／Hind111分別對質(zhì)粒pGL3BasicVecto

3、r和包含hTERTpromoter的質(zhì)粒CTS883P4進行酶切；將hTERTpromoter片段亞克隆入pGL3Basic線性載體；對重組質(zhì)粒進行酶切鑒定，測序驗證。2、用脂質(zhì)體法分別將重組質(zhì)粒pGL3hTERTpromoterLuc、陰性對照質(zhì)粒pGL3Basic、陽性對照質(zhì)粒pGL3Control轉(zhuǎn)染卵巢癌細胞SKOV3、SKOV3／DDP和臍靜脈內(nèi)皮細胞ECV304，24小時后于熒光顯微鏡下觀察。結(jié)果：l、成功構(gòu)建了帶有hTER

4、Tpromoter的重組質(zhì)粒pGL3。hTERTpromoterLuc，經(jīng)酶切鑒定和測序驗證正確。2、轉(zhuǎn)染了重組質(zhì)粒的SKOV3和SKOV3／DDP細胞能觀察到熒光，正常體細胞無熒光；轉(zhuǎn)染pGL3Basic質(zhì)粒的卵巢癌細胞和正常體細胞均未觀察到熒光。結(jié)論：hTERTpromoter只在腫瘤細胞中有活性，在正常體細胞中無活性。第二部分攜帶hTERTpromoter和ERCClshRNA的質(zhì)粒表達載體的構(gòu)建及RNA干擾效果檢測目的：構(gòu)建帶有

5、hTERTpromoter和ERCClshRNA的質(zhì)粒表達載體。方法：l、構(gòu)建PMDl8ThTERTpromoter質(zhì)粒。2、構(gòu)建pDNR—lrshRNA表達載體。3、構(gòu)建pDNR1rhTERTpromotershRNA載體。4、采用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染卵巢癌細胞株SKOV3和耐藥細胞株SKOV3／DDP，以J下常體細胞作對照，觀察RNA干擾效果(mRNA水平)。5、在蛋白水平檢測ERCCl基因的RNA干擾效果。結(jié)果：l、成功構(gòu)建PMDl8Th

6、TERTpromoter質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定和測序證實插入的外源基因序列正確：2、成功構(gòu)建pDNR一1rERCClshRNA表達載體。經(jīng)酶切鑒定和測序證實插入的外源基因序列正確；3、成功構(gòu)建pDNRlrhTERTpromotershRNA載體，經(jīng)酶切鑒定和測序證實插入的外源基因序列正確。4、RTPCR方法顯示，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后24、48、72h，SKOV3細胞內(nèi)ERCClmRNA分別下調(diào)(3502727)％，(4928246)％，(55544