丹參酮Ⅰ通過調(diào)節(jié)Nrf2-ARE信號通路在腎臟缺血再灌注損傷中的保護作用研究.pdf

1、目的:探討丹參酮Ⅰ在腎臟缺血再灌注損傷中的保護作用及相關(guān)機制。
　　方法:細胞實驗:1、利用不同濃度的丹參酮Ⅰ(TanshinoneⅠ，T-Ⅰ)處理人腎小管上皮細胞(HK-2)，利用CCK-8試劑盒檢測各組細胞活力，檢測T-Ⅰ藥物毒性;2、利用不同濃度的H2O2處理HK-2，2h后檢測各組細胞活力，選取構(gòu)建氧化應激模型最佳H2O2濃度;3、丹參酮Ⅰ藥效實驗:設置4個實驗組，對照組1(control)、對照組2(T-Ⅰ)、模型組1(

2、H2O2)、模型組2(H2O2+T-Ⅰ)，利用丹參酮Ⅰ或其溶劑處理24h，然后H2O2組及H2O2+T-Ⅰ組利用過氧化氫處理2h，CCK-8檢測各組細胞活力、流式細胞術(shù)AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法定量檢測各組細胞凋亡情況;4、通過DCFH-DA法對各組細胞內(nèi)的活性氧水平在熒光顯微鏡下觀察;5、利用RT-qPCR及Western Blot檢測各組細胞中Nrf2及其下游基因表達情況;6、Nrf2敲降之后利用RT-qPCR檢測細胞內(nèi)

3、Nrf2及其下游基因的表達，之后使用Nrf2-的HK-2重復丹參酮Ⅰ藥效實驗，檢測各組細胞活力。
　　動物實驗:1、32只8周雄性ICR小鼠隨機分為4組:假手術(shù)組1(sham)，假手術(shù)組2(sham+T-Ⅰ)，手術(shù)組1(IR)，手術(shù)組2（IR+T-Ⅰ），每組8只，sham+T-Ⅰ組及IR+T-Ⅰ組予以丹參酮Ⅰ腹腔注射兩周，sham組及IR組腹腔注射等量溶劑;2、建立腎臟缺血再灌注模型:手術(shù)組予以游離并夾閉左腎血管50min，切除右

4、腎;假手術(shù)組僅切除右腎，游離左腎血管，不阻斷血供;術(shù)后48h留取各組小鼠左腎組織及血清標本;3、檢測血清肌酐(SCr)、尿素氮（BUN）水平，評估腎臟功能;4、腎臟組織切片HE染色觀察組織形態(tài)學的改變，并進行組織病理學評分;5、檢測各組小鼠腎臟中SOD活力及MDA含量，評估氧化應激狀態(tài);6、通過免疫組化觀察腎臟組織中CD8、IL-6的表達，評估各組小鼠腎臟的炎癥狀態(tài);7、Tunel法檢測各組小鼠腎臟組織細胞凋亡情況;8、利用RT-qPC

5、R及WesternBlot檢測各組小鼠腎臟中Nrf2及其下游基因表達情況。
　　結(jié)果:細胞實驗:細胞毒性實驗顯示3.5μM及更低濃度的T-Ⅰ對HK-2沒有細胞毒性，過氧化氫毒性試驗顯示2mM為氧化應激模型最佳處理濃度;T-Ⅰ藥效實驗:T-Ⅰ可顯著減輕H2O2導致的HK-2細胞活力下降并且可以減少H2O2導致的細胞凋亡;DCFA-DA活性氧檢測結(jié)果顯示T-Ⅰ可顯著減少H2O2誘導后的細胞內(nèi)活性氧水平;信號通路研究發(fā)現(xiàn)T-Ⅰ可上調(diào)Nr

6、f2下游相關(guān)基因的mRNA以及蛋白水平，且能夠上調(diào)Nrf2在胞質(zhì)以及胞核的蛋白水平;且Nrf2敲降之后丹參酮Ⅰ不能改善H2O2導致的細胞活力下降。
　　動物實驗:T-Ⅰ可降低IR導致的小鼠血清肌酐、尿素氮升高，改善IR引起的腎臟組織病理學改變，且T-Ⅰ治療組小鼠腎臟炎癥狀態(tài)減輕、細胞凋亡減少;T-Ⅰ預處理可增加IR后腎臟組織內(nèi)SOD活力、降低MDA含量;信號通路研究發(fā)現(xiàn)T-Ⅰ可增加小鼠腎臟內(nèi)Nrf2表達及上調(diào)核內(nèi)Nrf2蛋白水平，