蝦青素在腎臟缺血再灌注損傷中的保護作用及機制研究.pdf

1、目的:
　　1、驗證蝦青素(astaxanthin，ATX)在腎臟缺血再灌注損傷中的保護作用。
　　2、探究ATX在腎臟缺血再灌注(renal ischemia reperfusion injury, RIRI)損傷中保護作用的機制。
　　方法:
　　細胞試驗部分:
　　1.ATX及H2O2毒性試驗，選取合適的H2O2濃度，不同濃度梯度的ATX預處理HK2細胞24h，H2O2處理HK2細胞2h，CCK-8法

2、、流式細胞術AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法測定細胞活力，驗證ATX藥效。
　　2.構建細胞模型，分為control組、ATX組，miRNA array篩選表達差異明顯的miRNA，應用實時定量PCR(RT-qPCR)、蛋白印跡法(Western blot)探究miRNA221-3p與PERK-CHOP信號通路間的作用機制。應用雙熒光素酶報告基因試驗(luciferase assay)驗證miRNA221-3p與PERK的關

3、系。
　　3.應用miRNA221-3p mimic及miRNA221-3p inhibitor分別轉染細胞后，用H2O2構建缺氧模型，CCK-8法及流式細胞術測定各組細胞活力，驗證miRNA221-3p在缺血再灌注損傷中的作用。RT-qPCR及Western blot探究miRNA221-3p對PERK-CHOP的調控作用。
　　動物實驗部分:
　　1.32只健康雄性8周大小B6小鼠隨機分為sham組（假手術組）、A

4、TX組、缺血再灌注組（RIRI組）及RIRI+ATX組，術后24h，收集血清及腎臟組織標本。檢測小鼠血清肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)水平，評估腎功能，并檢測小鼠新鮮腎臟組織中超氧化物歧化酶(SOD)活性及脂質過氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)的含量，評估小鼠缺血再灌注損傷的情況。組織切片HE染色評估小鼠腎臟病理學改變，及Tunel染色評檢測腎臟細胞凋亡情況。RT-qPCR、Western blot法檢測各組組織中miRNA221-3p、PER

5、K、eIF2α、p-eIF2α、CHOP的表達情況。
　　2.24只雄性8周大小B6小鼠隨機分為sham組、agomir組、RIRI組、RIRI+ agomir組。在小鼠注射miR221-3p agomir24h后，行小動物成像，測定miR221-3pagomir在小鼠腎臟組織的積聚情況。同樣檢測小鼠Cr、BUN水平，并檢測小鼠腎臟組織中SOD活性及MDA的含量，HE染色評估小鼠腎臟病理學改變，及Tunel染色評檢測腎臟細胞凋亡情

6、況。RT-qPCR、Western blot驗證miRNA221-3p與PERK間的關系。
　　結果:
　　1.ATX+H2O2組的細胞活力高于H2O2組且具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。
　　2.H2O2組較control組、ATX組PERK、CHOP表達量升高，miRNA221-3p表達下降(P＜0.05); ATX+H2O2組較H2O2組PERK、CHOP表達下降，miRNA221-3p表達升高(P＜0.05)。

7、
　　3.miRNA221-3p mimic轉染細胞后用H2O2處理，其細胞活力高于僅用H2O2處理組(P＜0.05)。而miRNA221-3p inhibitor轉染細胞后，用H2O2處理，其細胞活力則低于僅用H2O2處理組(P＜0.05)。
　　4.miRNA221-3p mimic轉染細胞后用H2O2處理，PERK、CHOP表達較僅用H2O2處理組下降(P＜0.05)，而miRNA221-3p inhibitor轉染細

8、胞后，用H2O2處理，PERK、CHOP表達較僅用H2O2處理組升高(P＜0.05)。
　　5.動物模型中，RIRI組較sham、ATX組肌酐、尿素氮升高，PERK、CHOP表達量升高，以及組織學表現(xiàn)凋亡更嚴重(P＜0.05)。而RIRI+ATX組較IR組肌酐、尿素氮下降，PERK、CHOP表達量升降低，以及組織學表現(xiàn)凋亡更輕(P＜0.05)。
　　6.同樣，在miR221-3p agomir的動物模型中，RIRI組較sha

9、m、agomir組肌酐、尿素氮升高，PERK、CHOP表達量升高，以及組織學表現(xiàn)凋亡更嚴重(P＜0.05)。而RIRI+agomir組較RIRI組肌酐、尿素氮下降，PERK、CHOP表達量升降低，以及組織學表現(xiàn)凋亡更輕(P＜0.05)。
　　結論:
　　1.ATX在H2O2模擬的氧化應激損傷及小鼠腎臟缺血再灌注損傷中起到保護作用，能有效減輕氧化應激損傷的程度。
　　2.PERK-CHOP信號通路在腎臟缺血再灌注損傷中發(fā)