MicroRNA--708在腦缺血再灌注損傷中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、在本文中，我們將深入探討miR-708在腦IRI中的作用及其作用靶點(diǎn)和作用機(jī)制，為開發(fā)出新的缺血性腦損傷治療靶點(diǎn)奠定理論基礎(chǔ)。
　　第一部分 miR-708在大鼠腦缺血再灌注中的表達(dá)
　　目的:
　　觀察大鼠MCAO模型中miR-708的表達(dá)，初步探討miR-708的表達(dá)與缺血再灌注損傷的關(guān)系。
　　方法:
　　取25只成年SD大鼠，隨機(jī)抽取10只僅做股動(dòng)脈分離，設(shè)為對(duì)照組，其余大鼠采用經(jīng)典的線栓法制備大鼠

2、MCAO模型，缺血90min后將線栓拔出，縫合傷口，將術(shù)后存活的10只SD大鼠設(shè)為實(shí)驗(yàn)組。再灌注24小時(shí)后，麻醉2組小鼠，通過眼眶取血（每只500μl），并用PBS通過心臟灌注后取腦梗死核心區(qū)組織。一部分組織用于切片，一部分組織用于提取RNA。用于切片的組織每隔2mm切一片，將切片置于TTC染液中染色后拍照，計(jì)算梗死體積。用于提取RNA的組織，利用Trizol提取RNA后反轉(zhuǎn)錄為cDNA，real-time PCR檢測(cè)miR-708的表

3、達(dá)。采集的大鼠全血通過試劑盒分離提取外周血mRNA，利用real-time PCR檢測(cè)miR-708的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　1.TTC染色結(jié)果顯示，對(duì)照組大鼠腦皮層下白質(zhì)的染色呈現(xiàn)紅色，而實(shí)驗(yàn)組大鼠腦皮層下白質(zhì)的TTC染色則呈現(xiàn)灰白色，表明皮層下梗死，說明造模成功。
　　2.與對(duì)照組相比，外周血及腦組織中實(shí)驗(yàn)組miR-708的mRNA表達(dá)顯著降低，說明miR-708的表達(dá)在腦IRI中降低。
　　結(jié)論:

4、>　　腦IRI的大鼠外周血及腦組織中miR-708表達(dá)降低。
　　第二部分 miR-708在體外細(xì)胞缺血再灌注模型中的作用
　　目的:
　　利用氧糖剝奪和復(fù)氧（Oxygen and glucose deprivation and reoxygenation，OGD/R)建立體外腦IRI模型闡明miR-708在腦IRI中的作用，包括對(duì)OGD/R細(xì)胞的增殖，凋亡，細(xì)胞周期分布，遷移，浸潤(rùn)以及神經(jīng)元標(biāo)志物表達(dá)的影響，以明確m

5、iR-708在腦IRI中的作用。
　　方法:
　　1.采用OGD/R處理人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞，構(gòu)建體外細(xì)胞IRI模型;
　　2.提取對(duì)照及OGD/R組細(xì)胞的RNA，利用real-time PCR的方法檢測(cè)miR-708的表達(dá);
　　3.采用AnnexinⅤ和PI雙染利用流式細(xì)胞檢測(cè)OGD/R后細(xì)胞的凋亡情況;
　　4.通過轉(zhuǎn)染miR-708的模擬物及對(duì)照檢測(cè)其對(duì)OGD/R引起的細(xì)胞凋亡(Anne

6、xinⅤ)及細(xì)胞周期（流式分析）的作用;
　　5.利用Transwell檢測(cè)miR-708模擬物對(duì)OGD/R細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和細(xì)胞侵襲能力的影響;
　　6.利用免疫熒光檢測(cè)神經(jīng)元標(biāo)志物MAP2的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.我們發(fā)現(xiàn)在體外細(xì)胞OGD/R模型中，細(xì)胞總凋亡率隨著OGD處理時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。在OGD處理6小時(shí)后，細(xì)胞凋亡顯著增加，達(dá)到對(duì)照的近10倍左右;
　　2.我們采用4/48小時(shí)（氧糖剝奪4小時(shí)，復(fù)氧

7、復(fù)糖48小時(shí)）的方案構(gòu)建體外腦IRI模型，發(fā)現(xiàn)在缺氧再復(fù)氧后，miR-708的表達(dá)顯著降低;
　　3.在體外模型OGD/R中轉(zhuǎn)染對(duì)照或miR-708的模擬物后，real-time PCR結(jié)果顯示miR-708模擬物顯著增加OGD/R中miR-708的表達(dá)水平，miR-708模擬物轉(zhuǎn)染的細(xì)胞增殖能力較對(duì)照顯著增強(qiáng)。此外，發(fā)現(xiàn)miR-708模擬物顯著降低OGD/R細(xì)胞的凋亡水平，從29.19％降到16.19％。另外，發(fā)現(xiàn)miR-708

8、模擬物顯著降低G1期細(xì)胞百分比，且顯著增加S期細(xì)胞百分比;
　　4.利用Tranwell和劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-708模擬物或?qū)φ辙D(zhuǎn)染的OGD/R細(xì)胞的遷移能力后發(fā)現(xiàn)，miR-708模擬物顯著提高細(xì)胞的遷移能力，達(dá)到對(duì)照的1.5倍左右。此外，miR-708模擬物顯著增加OGD/R細(xì)胞的浸潤(rùn)能力，達(dá)到對(duì)照的2倍左右;
　　5.將miR-708的模擬物轉(zhuǎn)染OGD/R細(xì)胞后，細(xì)胞中神經(jīng)元標(biāo)志物MAP2的表達(dá)明顯高于對(duì)照組。
　

9、　結(jié)論:
　　1.OGD/R引起SH-SY5Y細(xì)胞的凋亡隨缺血的時(shí)間延長(zhǎng)而增加;
　　2.miR-708的表達(dá)在OGD/R后顯著降低;
　　3.在OGD/R細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-708模擬物后，SH-SY5Y細(xì)胞增殖能力顯著增強(qiáng)，而細(xì)胞凋亡水平顯著下降，細(xì)胞周期的G1期百分比顯著下降，而S期細(xì)胞的百分比顯著增加;
　　4.miR-708顯著增加OGD/R細(xì)胞的遷移和浸潤(rùn)能力;
　　5.miR-708模擬物增加O

10、GD/R細(xì)胞中神經(jīng)元標(biāo)志物MAP2的表達(dá)。
　　第三部分 miR-708通過靶向JAK1保護(hù)OGD/R引起的損傷
　　目的:
　　明確miR-708的靶基因，并闡明miR-708及其靶基因在減輕腦IRI中的作用機(jī)制。
　　方法:
　　1.通過生物信息學(xué)分析確定miR-708的靶基因;
　　2.利用熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)miR-708對(duì)其靶基因熒光素酶活性的作用;
　　3.利用real-time

11、 PCR，免疫熒光和Western blot檢測(cè)靶基因的表達(dá);
　　4.轉(zhuǎn)染靶基因的siRNA，利用Hoechst檢測(cè)靶基因?qū)GD/R細(xì)胞凋亡的作用，并利用Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)信號(hào)通路蛋白的表達(dá)變化;
　　5.利用免疫熒光和real-time PCR檢測(cè)在OGD/R后干擾miR-708的靶基因JAK1表達(dá)后神經(jīng)元標(biāo)志物的表達(dá)變化。
　　6.利用real-time PCR檢測(cè)腦IRI模型及對(duì)照中JAK1

12、的表達(dá)，并統(tǒng)計(jì)JAK1與miR-708表達(dá)的相關(guān)性，利用Western blot檢測(cè)腦IRI模型及對(duì)照中JAK1及剪切型caspase3的蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.通過生物信息學(xué)方法分析JAK1為miR-708的靶基因，發(fā)現(xiàn)miR-708顯著降低野生型JAK1的熒光素酶活性，而miR-708對(duì)突變型JAK1的熒光素酶活性則無作用;
　　2.miR-708類似物顯著降低JAK1的表達(dá);
　　3.在OGD/R處

13、理的SH-SY5Y細(xì)胞中，JAK1mRNA表達(dá)顯著增加，達(dá)到對(duì)照的3倍，與mRNA相同，OGD/R細(xì)胞中的JAK1的蛋白表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組;
　　4.利用siRNA抑制JAK1的表達(dá)后，顯著降低OGD/R細(xì)胞的凋亡水平顯著降低，JAK1信號(hào)通路的下游分子STAT3的表達(dá)顯著降低，剪切型Caspase3表達(dá)顯著降低而Bc12家族的Mcl-1表達(dá)明顯增加;miR-708模擬物同樣顯著降低JAK1及其下游分子STAT3的表達(dá)，并下調(diào)

14、剪切型Caspase3的表達(dá)和上調(diào)Mcl-1的表達(dá);
　　3.miR-708模擬物和抑制JAK1的表達(dá)均顯著增加OGD/R細(xì)胞中神經(jīng)元標(biāo)志物MAP2和NeuN的mRNA表達(dá)水平;
　　4.與對(duì)照相比，大鼠腦IRI模型中JAK1的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著增加，且在IRI的大鼠腦組織中Caspase3的表達(dá)明顯高于對(duì)照組;相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)miR-708與JAK1表達(dá)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。
　　結(jié)論:
　　1.JAK1為miR-

15、708的靶基因，miR-708顯著降低野生型JAK1的熒光素活性;
　　2.在OGD/R細(xì)胞中，JAK1的轉(zhuǎn)錄(mRNA)和翻譯（蛋白）水平都顯著升高，在大鼠腦IRI模型中JAK1的表達(dá)也顯著增加;
　　3.與對(duì)照相比，miR-708模擬物轉(zhuǎn)染的OGD/R處理的SH-SY5Y細(xì)胞中JAK1的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著降低;
　　4.siRNA干擾JAK1的表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，OGD/R細(xì)胞的凋亡水平顯著降低，凋亡相關(guān)蛋白Cle